先天性肌病臨床、病理及分子生物學研究.pdf

1、先天性肌?。–ongenital myopathies, CMs）是一組單基因遺傳性骨骼肌疾病，臨床多以新生兒/幼年起病肌無力，伴/不伴肌張力低下，病情穩(wěn)定或緩慢進展，骨骼肌活檢具有特征性病理改變。根據(jù)特征性病理表現(xiàn)分類：1）軸空性肌?。ㄖ醒胼S空病/多迷你軸空病，軸空結(jié)構(gòu)）；2）中心核肌?。ㄖ行暮?肌管肌?。?）桿狀體肌?。U狀體/軸空-桿體/帽狀體）；4）肌球蛋白儲積?。ò麧{異常沉積）；5）肌纖維類型不均等癥（選擇性I型肌纖維萎縮）

2、。先天性肌病共同病理變化為：肌纖維直徑大小及類型分布異常，胞漿內(nèi)存在病理性特殊結(jié)構(gòu)；不同于肌營養(yǎng)不良及代謝性肌病的是：少見變性、壞死及再生肌纖維，無糖原及脂肪成分蓄積。
　　CMs遺傳方式復(fù)雜多樣，包括常染色體顯性遺傳（ Autosomal dominant inheritance, AD）、常染色體隱性遺傳（ Autosomal recessive inheritance, AR）、X連鎖隱性遺傳（X-linked recess

3、ive inheritance, XR）及散發(fā)多種遺傳方式，迄今為止發(fā)現(xiàn)30余種致病基因。CMs具有豐富的臨床/遺傳異質(zhì)性。每一類先天性肌病均具遺傳異質(zhì)性，如桿狀體肌病由NEB、TPM2、TPM3、ACTA1、TNNT1、CFL2、KBTBD13、KLHL40和KLHL41等基因變異致??；軸空性肌病由 RYR1、MYH7、SEPN1等基因變異致??；中心核肌病由MTM1、BIN1、DNM2、TTN基因變異致?。患±w維類型不均由 TPM2、

4、TPM3、RYR1、ACTA1、MYH7基因變異致病。臨床異質(zhì)性表現(xiàn)為：同一基因變異導(dǎo)致不同的病理現(xiàn)象，如RYR1變異可導(dǎo)致中央軸空病、迷你軸空病、中心核肌病、肌纖維類型不均；ACTA1變異可導(dǎo)致桿狀體肌?。ò睜铙w肌?。?、肌動蛋白絲聚合病、肌纖維類型不均。
　　CMs臨床診斷面臨的問題如下：1）臨床表型相似，造成CMs診斷困難；2）相同病理特點可由不同致病基因?qū)е拢?）CMs與肌原纖維病致病基因重疊；4）某些致病基因外顯子數(shù)目

5、巨大。復(fù)雜的臨床/遺傳異質(zhì)性使CMs的診斷必須基于致病基因分析；傳統(tǒng)的基于CMs骨骼肌病理活檢特定的結(jié)構(gòu)改變，可提示基因測序方向，但CMs上述臨床及遺傳學特點，使用傳統(tǒng) Sanger法基因分析在診斷陽性率、鑒別診斷、分型診斷及診斷時效方面均存在局限性，桎梏了CMs的分子生物學診斷廣泛應(yīng)用于臨床。
　　目的基因捕獲二代測序（Next generation sequencing, NGS）技術(shù)，能夠一次性對多個基因的全部外顯子捕獲、測

6、序，堿基覆蓋度達到99％，對每一個堿基檢測平均重數(shù)（測序深度）達100重以上，快速、準確、一次性完成多個目的基因的外顯子測序，相比全外顯子及全基因組測序，其所用時間少、單堿基測序費用低及生物信息分析相對簡單，因此更多應(yīng)用于臨床。同時目的基因捕獲NGS技術(shù)學特點，解決了Sanger測序在CMs分子生物學診斷中的不足，推動CMs分子生物學分型診斷及鑒別診斷。
　　本研究從河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院骨骼肌遺傳資源標本庫（2005.3-2015

7、.12，1471例）篩選：1）中央軸空?。?例）；2）中心核肌?。?例）；進行臨床、病理分析，目的基因捕獲NGS進行致病基因篩查，生物信息學分析得出的位點經(jīng)患者及其無癥狀親屬（22例）Sanger法驗證。
　　第一部分中央軸空病臨床、病理及基因分析
　　目的：本部分基于臨床、活檢骨骼肌病理診斷，篩選9例中央軸空病（Central core disease, CCD）患者，采用軸空性肌病目的基因捕獲NGS技術(shù)、Sanger驗證

8、，確定致病基因及突變類型，分析、總結(jié)中國人群CCD臨床、病理及基因變異特點，并探討目的基因捕獲 NGS在 CCD診斷中的應(yīng)用價值。
　　方法：
　　1臨床病例入選標準：1）臨床表現(xiàn)：嬰幼兒起病的緩慢進展的四肢近端肌、腰帶肌無力、萎縮，伴/不伴骨骼肌外并發(fā)癥及面肌受累；2）CK正?；蜉p度升高，肌電圖呈肌源性損害或正常；3）活檢骨骼肌組織化學染色呈典型中央軸空結(jié)構(gòu)，除外肌營養(yǎng)不良改變，糖原、脂類正常。
　　2歸納整理入組患

9、者臨床資料，包括：性別、發(fā)病年齡、血 CK、電生理檢查結(jié)果，2例（病例1、7）行骨盆CT（Computerized Tomography, CT）檢查。
　　3活檢骨骼肌組織化學，病理分析；4例患者（病例2、3、4、8）行電子顯微鏡超微結(jié)構(gòu)分析。
　　4軸空性肌病目的基因富集（RYR1、MYH7、SEPN1）二代測序，生物信息學分析致病基因，對發(fā)現(xiàn)的突變應(yīng)用 Sanger法對患者（9例）及部分無癥狀親屬（9例）驗證。

10、　　結(jié)果：
　　19例CCD患者中，男性3例，女性6例，陽性家族史者3例，年齡2-32歲，全部為出生后或嬰幼兒期起病。臨床表現(xiàn)為輕-中度的非進行性近端肌無力、肌張力低下；5例具有特殊容貌（高腭弓、倒V型嘴、細長臉等），6例患者伴骨骼肌外并發(fā)癥（關(guān)節(jié)過伸展、跟腱攣縮等、脊柱側(cè)彎先天性髖關(guān)節(jié)脫位）。血CK輕度升高1例，正常8例。EMG呈肌源性損害6例，正常3例。
　　2例骨盆CT示髖臼發(fā)育不良及臀肌萎縮。
　　2活檢骨骼肌

11、組織化學染色（9例）：肌纖維未見明顯變性、壞死和再生，肌纖維輕-中度大小不等，可見典型中央軸空結(jié)構(gòu)，呈單個或多個，位于肌纖維中央或偏側(cè)。所有病例均表現(xiàn)為I型肌纖維萎縮；肌纖維類型分布：單一I型肌纖維5例，I型肌纖維優(yōu)勢4例。
　　電子顯微鏡超微結(jié)構(gòu)特點（4例）：軸空區(qū)域肌纖維結(jié)構(gòu)紊亂，線粒體缺失。
　　3目的基因捕獲NGS分析、Sanger驗證，8例患者致病基因為RYR1，共發(fā)現(xiàn)5個雜合突變（新發(fā)突變2個，已報位點3個）。具

12、體如下：3例新發(fā)突變（c.13732T>G和 c.13915_13923del），3例 c.14582G>A，1例c.14581C>T，1例 c.13919T>G。其中2例 RYR1為 de novo突變（c.13919T>G和c.13915_13923del）。
　　1例（例6）于RYR1、MYH7、SEPN1均未發(fā)現(xiàn)具有臨床意義致病突變。
　　結(jié)論：
　　1 CCD符合CMs的一般臨床表現(xiàn)。
　　2活檢骨骼肌

13、病理分析，中央軸空是診斷與鑒別診斷其他類型CMs、兒童遺傳性骨骼肌疾病的重要方法。
　　3 RYR1可能為中國人CCD常見致病基因，可能存在外顯子94-101的附近熱點突變區(qū)域。
　　4 NGS對于發(fā)現(xiàn)CCD的RYR1以外基因變異具有篩查價值。
　　第二部分中心核肌病臨床、病理及分子生物學分析
　　目的：中心核肌?。–entronuclear myopathies, CNMs）根據(jù)遺傳方式及臨床表現(xiàn)分為三類：XR

14、遺傳（MTM1）、AD遺傳（DNM2、CCDC78等）及 AR遺傳（BIN1、RYR1等）。不同的類型存在不同的臨床表現(xiàn)和不同的預(yù)后。其中女性 MTM1變異攜帶者患者僅有個例報道，其發(fā)病機制可能與X染色體失活偏移（Skewed X-chromosome inactivation, SXCI）有關(guān)。
　　本部分篩選經(jīng)臨床、活檢骨骼肌病理診斷的CNMs患者7例，使用中心核肌病目的基因捕獲NGS測序技術(shù)，篩選致病基因，并對2例MTM1女

15、性攜帶者進行X染色體失活分析?？偨Y(jié)不同亞型CNMs臨床、下肢骨骼肌MRI特點、骨骼肌病理特點；確定一組中國人群CNMs致病基因及突變類型，總結(jié)基因變異特點。
　　方法：
　　1臨床病例入選標準：1）臨床表現(xiàn)：符合 CMs，包括嬰幼兒起病的緩慢進行性加重肌無力、萎縮，運動發(fā)育遲緩，伴/不伴骨骼肌外并發(fā)癥（關(guān)節(jié)攣縮、脊柱側(cè)彎）及面肌受累（細長臉、高腭弓、眼外肌麻痹等）；2）CK正?；蜉p度升高，肌電圖正?；虺始≡葱該p害；3）活檢骨

16、骼肌組織化學染色中心核肌纖維比例增加，除外肌營養(yǎng)不良改變，糖原、脂類正常。
　　2歸納整理入組患者臨床資料，包括：性別、發(fā)病年齡、血 CK、電生理檢查結(jié)果，5例患者（病例2、3、4、6、7）行雙下肢骨骼肌核磁共振成像（Magnetic resonance imaging, MRI）檢查。
　　3活檢骨骼肌組織化學，病理分析；2例患者（病例1、7）行電子顯微鏡超微結(jié)構(gòu)分析。
　　4中心核肌病目的基因捕獲（MTM1、DNM

17、2、BIN1、RYR1、CCDC78、TTN、SPEG、MTMR14）NGS測序，生物信息學分析致病基因，對發(fā)現(xiàn)的突變應(yīng)用Sanger法對患者（7例）及無癥狀親屬（12例）家系驗證。
　　5 X染色體失活（X chromosome inactivation，XCI）分析：2例MTM1變異的女性患者， PCR其外周血 DNA擴增雄性激素受體（ Androgen receptor, AR）基因第1外顯子CAG重復(fù)序列的多肽性分析X染色

18、體失活。X染色體失活時，位于該重復(fù)序列附近的甲基化敏感性內(nèi)切酶Hpa II的酶切位點被甲基化而不能被切斷，而有活性的 X染色體則相反。因此，如先用Hpa II對基因組DNA酶切后再進行PCR擴增，僅有失活X染色體有產(chǎn)物。
　　結(jié)果：
　　17例CNMs患者中，男性3例，女性4例，例1具陽性家族史，其余患者無陽性家族史。年齡3-47歲，均為生后或嬰幼兒期起病，病情緩慢進展。3例（病例4、5、6）為遠端肌無力為主要及首發(fā)癥狀，其

19、余4例主要表現(xiàn)為四肢近端肌無力。5例具有特殊面容（細長面容、高腭弓），3例伴眼外肌受累（眼瞼下垂、眼外肌麻痹），4例伴骨關(guān)節(jié)異常（脊柱側(cè)凸、跟腱攣縮、手指關(guān)節(jié)畸形及過伸展）；CK正常6例，升高1例；EMG呈肌源性改變。
　　下肢骨骼肌MRI：例4、6為小腿重于大腿，例2、3、7大腿重于小腿。其中例4、6大腿前群肌（股中間?。┲赜诤笕?，而小腿以后群肌受累為主（比目魚?。焕?、7大腿后群肌受累重于前群，小腿以腓腸肌及脛骨前肌輕度受累

20、；例3小腿肌群無明顯受累。
　　2活檢骨骼肌組織化學染色（7例）：未見明顯肌纖維變性、壞死和再生，肌纖維大小不等，脂肪結(jié)締組織輕-重度增生（例2彌漫性脂肪浸潤）。中心核及核集中肌纖維顯著增加；I型肌纖維小徑化，2例為I型肌纖維優(yōu)勢，2例為單一I型肌纖維，其中MTM1-CNM（例1）可見項圈纖維， DNM2-CNM（例4、5、6）及RYR1-CNM（例7）可見輪輻狀肌纖維(Radial sarcoplasmic strands，RS

21、S)。
　　電子顯微鏡超微結(jié)構(gòu)特點（2例）：可見中心核呈鏈狀排列，中心核周邊區(qū)域線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復(fù)合體、糖原顆粒聚集。
　　3目的基因捕獲NGS測序、Sanger驗證，病例1、2、3為MTM1變異（分別為 c.1054-1G>A、c.286dupA、 c.1405C>G）；病例4、5、6為DNM2變異（分別為c.1106G>A、c.1102G>A、c.1105C>T）；例7為RYR1變異（c.12237delC、c.1

22、2536G>A），其中 MTM1（c.1405C>G）及 RYR1（c.12237delC）為新發(fā)突變，病例4、5為de novo突變。根據(jù)基因分析結(jié)果，將7例患者分型診斷：病例1、2、3為MTM1變異X連鎖隱性遺傳肌管疾病（X-linked recessive myotubular myopathy, XLMTM），病例4、5、6為DNM2變異的常染色體顯性遺傳CNM,病例7為RYR1變異常染色體隱性遺傳CNM。
　　4病例1和

23、2X染色體失活分析：XCI>80%(病例1XCI傾斜率為84:16，病例2XCI傾斜率為83:17)，為SXCI。
　　結(jié)論：
　　1 CNMsCNMs表型相似，臨床不能明確分型診斷； DNM2-CNM具有相對一致的臨床表型，表現(xiàn)為下肢遠端為重的肌無力，有待進一步增加樣本量研究。
　　2特征性骨骼肌受累肌群，一定程度上提示 CNMs亞型，指導(dǎo)致病基因測序方向，同時可以進一步指導(dǎo)骨骼肌活檢部位。
　　3中心核肌纖維

24、明顯增多是特征性病理改變，對 CNMs與其他類型CMs及其他遺傳性骨骼肌疾病的具有診斷、鑒別診斷價值。
　　4 CNMs多個基因、點突變致病，應(yīng)將CNMs視為一疾病譜系，臨床表型相似、高度遺傳異質(zhì)性，建議基因分析首選 NGS，一次性完成診斷與鑒別診斷。
　　5 MTM1變異的女性攜帶者能夠發(fā)病并有較嚴重的臨床表現(xiàn)及典型中心核病理特點，癥狀較男性患者輕，可能與SXCI有關(guān)，女性XLMTM攜帶必要時應(yīng)行XCI分析。
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