基于單粒子分析方法的水體總菌檢測(cè)系統(tǒng)關(guān)鍵技術(shù)研究.pdf

1、目的:本文所述課題旨在課題組研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步掌握單粒子檢測(cè)技術(shù)并將其應(yīng)用于水體細(xì)菌總數(shù)的檢測(cè)。在系統(tǒng)樣機(jī)研制的過(guò)程中積累經(jīng)驗(yàn)，助力于單粒子檢測(cè)技術(shù)在水體樣本檢測(cè)專(zhuān)項(xiàng)應(yīng)用方面的推廣，為單粒子檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用提供新的思路。
　　方法和內(nèi)容:
　　通過(guò)對(duì)現(xiàn)有的流式檢測(cè)原理進(jìn)行剖析，在國(guó)外已有的檢測(cè)技術(shù)和相關(guān)裝備的基礎(chǔ)上，提出單粒子水體總菌檢測(cè)系統(tǒng)關(guān)鍵技術(shù)研究和實(shí)驗(yàn)裝置的研制。主要研究?jī)?nèi)容及方法包括:
　?、?樣本前處理方法

2、研究;通過(guò)查閱文獻(xiàn)及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，對(duì)不同原理的前處理方法進(jìn)行探索，對(duì)比不同染料、不同碳點(diǎn)對(duì)細(xì)菌的染色效果，確立課題所使用的染色方案在該檢測(cè)原理下的可行性與準(zhǔn)確性;通過(guò)前處理方案的確定，為光路系統(tǒng)光源選擇、探測(cè)通道鏡片參數(shù)制定提供必要的設(shè)計(jì)參數(shù)。
　?、?光學(xué)模塊設(shè)計(jì)與參數(shù)優(yōu)化;將光路模塊從總體上分為激發(fā)光路與檢測(cè)光路兩部分，通過(guò)理論仿真分析，設(shè)計(jì)激光光路實(shí)現(xiàn)對(duì)原始光斑的整形從而得到理想的檢測(cè)光斑;設(shè)計(jì)檢測(cè)光路對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行選擇性接收;

3、在課題中對(duì)該系統(tǒng)的光源選擇、鏡片參數(shù)、光路結(jié)構(gòu)三個(gè)方面進(jìn)行系統(tǒng)性?xún)?yōu)化，并依據(jù)前處理方案擬定的染料特性對(duì)檢測(cè)光路參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化處理。
　?、?液流模塊設(shè)計(jì)與參數(shù)優(yōu)化;通過(guò)不同設(shè)計(jì)方案對(duì)比，使用不同動(dòng)力源控制樣本液和鞘液，使其在檢測(cè)區(qū)形成由外部鞘液流包裹內(nèi)部樣本液流的同軸流動(dòng)模式，通過(guò)對(duì)液流系統(tǒng)效果進(jìn)行評(píng)價(jià)分析，優(yōu)化設(shè)計(jì)方案與控制參數(shù)。課題通過(guò)實(shí)驗(yàn)探索，確定了具有較高安全性的進(jìn)樣液路及整體流路方案。
　　Ⅳ.信號(hào)處理模塊設(shè)計(jì)與優(yōu)化

4、;系統(tǒng)在檢測(cè)區(qū)由激發(fā)光斑激發(fā)染色后的細(xì)菌，經(jīng)過(guò)檢測(cè)光路對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行探測(cè)收集，通過(guò)光電倍增管將光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，再經(jīng)過(guò)放大、濾波、AD轉(zhuǎn)換后成為數(shù)字信號(hào)傳遞給FPGA主控芯片。課題中針對(duì)系統(tǒng)的信號(hào)特點(diǎn)進(jìn)行了相關(guān)電路設(shè)計(jì)及參數(shù)優(yōu)化，繪制PCB板并完成電路系統(tǒng)調(diào)試。
　?、?峰值處理算法的提出以及驗(yàn)證;對(duì)微米級(jí)待測(cè)樣本粒子經(jīng)熒光染色后熒光信號(hào)強(qiáng)度分布進(jìn)行建模仿真，探尋待測(cè)樣本熒光信號(hào)的特征，結(jié)合系統(tǒng)檢測(cè)平臺(tái)的檢測(cè)需求設(shè)計(jì)具有針對(duì)性的

5、信號(hào)處理方法，在Verilog語(yǔ)言環(huán)境下實(shí)現(xiàn)算法的應(yīng)用并通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證算法的準(zhǔn)確性及穩(wěn)定性，對(duì)算法進(jìn)行優(yōu)化。
　　Ⅵ.系統(tǒng)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)與優(yōu)化;在系統(tǒng)搭建初期，采用獨(dú)立的分模塊構(gòu)建方案，將總體系統(tǒng)劃分為幾個(gè)子系統(tǒng)模塊，在逐步實(shí)現(xiàn)各個(gè)模塊的擬定功能后，為了提高系統(tǒng)集成度，在控制系統(tǒng)采用以FPGA為核心的控制方案，在硬件電路中圍繞FPGA為核心分別構(gòu)建中心電源板、信號(hào)處理板、信號(hào)控制板以及微控板為主體的4塊直插式電路控制系統(tǒng)，將各獨(dú)立模塊綜合

6、集成為一體，優(yōu)化系統(tǒng)結(jié)構(gòu)。
　　結(jié)果:
　?、?光路系統(tǒng)采用設(shè)計(jì)方案后激光器原始光斑大小約為844*765um，橢圓度約為0.906，經(jīng)過(guò)XY雙軸整形透鏡組整形后，在檢測(cè)點(diǎn)位置光斑大小77.8*19.8um，在焦點(diǎn)位置附近光斑變化趨勢(shì)較小，具有較好的穩(wěn)定性。
　?、?液流系統(tǒng)分別采用柱塞泵與氣壓泵作為動(dòng)力源，解決了樣本“死體積”問(wèn)題引入的污染，避免了“脈動(dòng)”問(wèn)題帶來(lái)的樣本回流現(xiàn)象;使樣品進(jìn)樣不受樣本管體積限制，實(shí)現(xiàn)連續(xù)

7、檢測(cè);大約0.4s即可在鞘液液瓶中建立穩(wěn)定的氣壓，電壓值約為1.1v，穩(wěn)定效果較好。
　　Ⅲ.峰值處理算法重復(fù)檢測(cè)10組樣本相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.36％，并且僅需3個(gè)參數(shù)即可實(shí)現(xiàn)系統(tǒng)信號(hào)的快速處理，與現(xiàn)有檢測(cè)方法相比具有較好的一致性，可滿足系統(tǒng)的檢測(cè)需求。
　?、?整體系統(tǒng)微球測(cè)試表明當(dāng)進(jìn)樣速度處于0.5ul/s-1ul/s之間時(shí)，樣本檢測(cè)結(jié)果間差異較小，檢測(cè)過(guò)程更穩(wěn)定;針對(duì)不同濃度樣本檢測(cè)CV值均在2-3.5之間，達(dá)到了較好的

8、檢測(cè)精度。
　?、?系統(tǒng)整體測(cè)試人工添加金黃色葡萄球菌10倍梯度濃度結(jié)果表明，目前系統(tǒng)最佳檢測(cè)限為103-106cfu/ml濃度范圍，在該檢測(cè)限內(nèi)與平皿計(jì)數(shù)法檢測(cè)結(jié)果具有較好的一致性，在低于該檢測(cè)限時(shí)檢測(cè)結(jié)果明顯高于平皿計(jì)數(shù)法;與現(xiàn)有流式細(xì)胞儀的統(tǒng)計(jì)結(jié)果始終保持較好的一致性。
　　總結(jié)與展望:
　?、?在現(xiàn)有樣機(jī)的基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)子系統(tǒng)各部分分別優(yōu)化，進(jìn)一步提高整體系統(tǒng)的檢測(cè)靈敏度。
　　Ⅱ.增加熒光收集通道，在理