基于單粒子探測的生鮮牛乳中體細(xì)胞快速檢測關(guān)鍵技術(shù)研究.pdf

1、目的：
　　生鮮牛乳中的體細(xì)胞是奶牛乳腺中的體細(xì)胞通過腺泡由血液滲入乳汁的。正常生鮮牛乳中的體細(xì)胞數(shù)（SCC）為20萬個(gè)/ml~30萬個(gè)/ml，其中白細(xì)胞占98％，國際上規(guī)定50萬個(gè)/ml的體細(xì)胞數(shù)為乳腺炎的基準(zhǔn)，超過該指標(biāo)時(shí)，奶?；既橄傺椎目赡苄噪S之增大。SCC作為原料奶的一項(xiàng)重要質(zhì)量指標(biāo)，一方面可以監(jiān)控奶牛乳腺健康狀況，另一方面，體細(xì)胞過高對牛乳成分和品質(zhì)也會(huì)產(chǎn)生影響，牛乳體細(xì)胞檢測是牛乳相關(guān)食品安全的技術(shù)保障。
　　傳

2、統(tǒng)體細(xì)胞檢測方法可分為直接和間接檢測法兩類：間接傳統(tǒng)細(xì)胞檢驗(yàn)技術(shù)是利用牛乳體細(xì)胞的物化特性進(jìn)行測試，經(jīng)濟(jì)、簡便但檢測精度普遍較低；直接檢測法中顯微鏡計(jì)數(shù)法是體細(xì)胞檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，但操作繁瑣費(fèi)時(shí)。基于單粒子探測原理的體細(xì)胞儀自動(dòng)化程度高、快速準(zhǔn)確，成為目前國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。但是由于生鮮牛乳作為一種多分散質(zhì)乳濁液成分復(fù)雜，涉及樣本前處理、探測光路和穩(wěn)態(tài)液路等多個(gè)模塊，因此基于單粒子探測原理的體細(xì)胞檢測方法尚未完全發(fā)展成熟。
　　綜上，本

3、課題首先開展生鮮牛乳樣本熒光特性分析，然后對單粒子探測過程中涉及的光路和液路模塊的優(yōu)化方案進(jìn)行討論并試制樣機(jī)，并完成樣機(jī)的系統(tǒng)性能指標(biāo)與計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性的評價(jià)測試，最終提出一套基于單粒子探測原理的體細(xì)胞檢測標(biāo)準(zhǔn)流程，實(shí)現(xiàn)體細(xì)胞檢測專用平臺(tái)關(guān)鍵技術(shù)突破，為生鮮牛乳體細(xì)胞現(xiàn)場快速定量檢測提供科學(xué)的解決方案。
　　研究內(nèi)容和研究方法：
　　本文設(shè)計(jì)課題以生鮮牛乳中的體細(xì)胞作為探測目標(biāo)，針對生鮮牛乳這一多分散質(zhì)乳濁液，排除蛋白質(zhì)、脂肪球以

4、及其中可能存在的其它粒子熒光對體細(xì)胞的干擾，確定樣本檢測方案。在課題組現(xiàn)有單粒子探測技術(shù)研究的基礎(chǔ)上，通過對體細(xì)胞單粒子探測系統(tǒng)中關(guān)鍵技術(shù)與模塊單元實(shí)現(xiàn)方法的討論，優(yōu)化探測光路與穩(wěn)態(tài)液路核心模塊，并對體細(xì)胞檢測系統(tǒng)平臺(tái)進(jìn)行工程化實(shí)現(xiàn)。對體細(xì)胞檢測單粒子系統(tǒng)性能評價(jià)方法進(jìn)行討論并對相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行測試，在各項(xiàng)指標(biāo)均合格的條件下，完成計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性測試實(shí)驗(yàn)：以傳統(tǒng)鏡檢法為對照，考察本系統(tǒng)是否可以實(shí)現(xiàn)對生鮮牛乳中體細(xì)胞的準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。
　　具體研究

5、方法和研究內(nèi)容包括以下四個(gè)方面。
　　1)生鮮牛乳熒光特性的分析和討論：單粒子探測對所要分析的樣品背景熒光有比較嚴(yán)格的要求，與目標(biāo)物的熒光發(fā)射峰相近的自體熒光信號(hào)會(huì)影響檢測結(jié)果。因此，課題通過檢測生鮮牛乳的內(nèi)源性熒光，借助熒光光譜對潛在的干擾物內(nèi)源性熒光特性進(jìn)行分析，找出影響體細(xì)胞單粒子探測的干擾波段。以自體熒光分析結(jié)果為生鮮牛乳中體細(xì)胞樣本檢測方案設(shè)計(jì)的理論基礎(chǔ)，確定光源、染料和探測通道設(shè)置，以確保生鮮牛乳中體細(xì)胞的能被準(zhǔn)確識(shí)別

6、。
　　2)體細(xì)胞單粒子探測系統(tǒng)中的光路模塊關(guān)鍵技術(shù)研究：光路模塊主要是整形光路與探測光路兩部分。為獲得厚度一定且能量密度呈高斯分布的線型光斑，需設(shè)計(jì)整形光路，然后基于ZEMAX光學(xué)仿真軟件進(jìn)行仿真，并根據(jù)仿真結(jié)果來指導(dǎo)光學(xué)平臺(tái)的搭建，進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。體細(xì)胞單粒子探測通道的優(yōu)化設(shè)計(jì)包括光收集和共焦降噪兩部分，通過分析采集到的原始信號(hào)，優(yōu)化探測通道參數(shù)設(shè)置，以提高探測通道收集效率和靈敏度。
　　3)體細(xì)胞單粒子探測系統(tǒng)中的液路模

7、塊關(guān)鍵技術(shù)研究：針對單粒子探測系統(tǒng)中涉及的流動(dòng)池和液體管路系統(tǒng)兩部分進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)。首先對鞘液流速參數(shù)進(jìn)行探索性實(shí)驗(yàn)，確保流體在兩級鞘液聚焦設(shè)計(jì)的流動(dòng)池中以穩(wěn)定的層流狀態(tài)流動(dòng)。然后設(shè)置不同的鞘液/樣本液流速比，通過Fluent仿真觀察其對聚焦后樣本流直徑的影響，分析聚焦效果最優(yōu)的流速比值范圍，并以穩(wěn)定性最佳的液流流段作為激光檢測段。管路系統(tǒng)優(yōu)化則是對原管路模塊存在的問題進(jìn)行分析并改進(jìn)，在每份樣本檢測結(jié)束時(shí)添加自動(dòng)清洗機(jī)制，實(shí)現(xiàn)對流動(dòng)池、管

8、壁和進(jìn)樣針及時(shí)有效的雙向清洗，減少牛乳樣本液對管路的污染，降低系統(tǒng)攜帶污染率，確保檢測結(jié)果的可靠性。
　　4)體細(xì)胞單粒子探測系統(tǒng)性能評價(jià)方法研究與相關(guān)指標(biāo)測試：體細(xì)胞單粒子探測系統(tǒng)的性能評價(jià)包括系統(tǒng)指標(biāo)和計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性兩部分。完成系統(tǒng)光路、液路優(yōu)化后，將系統(tǒng)各模塊聯(lián)合裝配，參考單粒子技術(shù)指標(biāo)的一般要求，進(jìn)行單粒子樣機(jī)系統(tǒng)指標(biāo)測試，主要包括分辨率、線性、靈敏度和攜帶污染率等指標(biāo)，一方面對優(yōu)化效果進(jìn)行驗(yàn)證，另一方面，為牛乳樣本的體細(xì)胞檢

9、測的可靠性提供支持與保證。在單粒子樣機(jī)系統(tǒng)指標(biāo)測試達(dá)標(biāo)的情況下，以金標(biāo)準(zhǔn)顯微鏡計(jì)數(shù)和現(xiàn)有流式細(xì)胞儀為對照，進(jìn)行不同濃度體細(xì)胞計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性對比實(shí)驗(yàn)。
　　本課題通過以上四個(gè)方面開展研究工作，針對生鮮牛乳體細(xì)胞這一專項(xiàng)檢查，提出標(biāo)準(zhǔn)檢測流程，實(shí)現(xiàn)體細(xì)胞檢測專用平臺(tái)關(guān)鍵技術(shù)突破，為牛乳體細(xì)胞現(xiàn)場快速定量檢測提供支撐。
　　本文的創(chuàng)新點(diǎn)，一是在傳統(tǒng)液力聚焦的基礎(chǔ)上提出兩級液力聚焦設(shè)計(jì)，提高了流體約束水平；二是形成了單激光單通道精簡檢測

10、系統(tǒng)，在我國首次提出了一套基于單粒子探測原理的牛乳體細(xì)胞檢測完整方法。
　　結(jié)果：
　　生鮮牛乳熒光特性實(shí)驗(yàn)結(jié)果：生鮮牛乳樣本在300~420nm激發(fā)下，自體熒光發(fā)射峰在525nm左右。選取405nm激光器和DAPI核酸熒光染料，對生鮮牛乳樣本進(jìn)行染色檢測，體細(xì)胞發(fā)射的熒光峰在460nm左右，與牛乳的自體熒光有較好的區(qū)分，單熒光通道即可實(shí)現(xiàn)體細(xì)胞的檢測。
　　體細(xì)胞單粒子探測系統(tǒng)光路優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果：經(jīng)柱鏡組整形后的光斑在

11、檢測區(qū)的尺寸約為100μm×20μm，光斑能量密度呈高斯分布。仿真實(shí)驗(yàn)與光學(xué)平臺(tái)實(shí)際獲得光斑結(jié)果一致，調(diào)整兩柱鏡到檢測區(qū)的距離，可實(shí)現(xiàn)離焦，獲得一組厚度為5~30μm不同的高斯光斑。RCP-30-5A-2熒光微球在PMT增益700mV下電壓響應(yīng)信號(hào)數(shù)據(jù)顯示，探測通道設(shè)置共焦模塊后，較無共焦模塊時(shí)信噪比提高了0.57倍；在共焦模塊添加光闌后，較無光闌時(shí)信噪比又提高了0.72倍。可見探測通道添加共焦和光闌，對大增益下微弱信號(hào)的信噪比有較好的

12、提升效果。
　　體細(xì)胞單粒子探測系統(tǒng)兩級鞘液聚焦優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果：將樣本流速率設(shè)置為較高的1μl/s，鞘液/樣本液流速比在5~15倍范圍內(nèi)時(shí)，鞘液與樣本液在兩級鞘液聚焦下為層流，理想條件下聚焦效果較好的樣本流直徑理論值在10μm內(nèi)。單級、兩級液力聚焦結(jié)構(gòu)的 fluent仿真結(jié)果與理論計(jì)算趨勢一致，在鞘液/樣本液流速比相同的情況下，兩級液力聚焦后的樣本流直徑均小于單級液力聚焦。檢測段中間區(qū)域?qū)恿鬏^穩(wěn)定，適于激光檢測。
　　體細(xì)胞單

13、粒子探測系統(tǒng)性能評價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果：用標(biāo)準(zhǔn)熒光微球測試，變異系數(shù)CV值隨進(jìn)樣速率增大而增大，進(jìn)樣速率1μl/s以內(nèi)，CV均小于2%。用8 peaks微球測試，熒光通道內(nèi)粒子的平均熒光強(qiáng)度與其所攜帶的熒光分子總數(shù)之間的線性相關(guān)性R2=0.9921，CSB通道的熒光靈敏度為3.83 MESF。攜帶污染率3組重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果，攜帶污染率C最大值為0.80%，平均值為0.76%。
　　體細(xì)胞單粒子探測系統(tǒng)SCC計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性實(shí)驗(yàn)結(jié)果：離心樣本SCC普遍

14、低于不離心的樣本，兩組實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異極其顯著(P＜0.01)。對不同濃度體細(xì)胞樣本計(jì)數(shù)，單粒子樣機(jī)與ife流式細(xì)胞儀、熒光顯微鏡測得SCC數(shù)據(jù)組間差異不顯著(P＞0.05)。單粒子樣機(jī)的SCC計(jì)數(shù)結(jié)果是熒光顯微鏡SCC的91.92%以上，是life流式細(xì)胞儀SCC的98.64%以上。重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)差分析顯示，低體細(xì)胞濃度樣本下，熒光顯微鏡的重復(fù)性高于流式細(xì)胞儀和單粒子樣機(jī)，而高體細(xì)胞濃度樣本下，熒光顯微鏡的重復(fù)性較低，單粒子樣機(jī)的重