水菖蒲乙酸乙酯提取物對腸道內(nèi)分泌激素GLP-1表達(dá)分泌的影響及分子機(jī)制研究.pdf

1、研究目的:
　　本論文探討水菖蒲乙酸乙酯提取物(ACE)的抗糖尿病作用及其對腸道胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)表達(dá)和分泌的影響，并對其分子機(jī)制進(jìn)行研究，為水菖蒲抗糖尿病的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)和方向，為藥物抗糖尿病作用及基于GLP-1的分子機(jī)制研究提供思路和方法。
　　研究方法:
　　1.水菖蒲乙酸乙酯提取物基于GLP-1的體內(nèi)抗糖尿病藥效和機(jī)制研究
　　采用鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)高血糖小鼠、遺傳性肥胖型db

2、/db糖尿病小鼠、飲食誘導(dǎo)肥胖(DIO)小鼠對ACE進(jìn)行體內(nèi)抗糖尿病藥效學(xué)評價。采用同周齡同背景小鼠作為正常對照組，糖尿病模型小鼠按血糖隨機(jī)分為3組，分別為模型對照組、二甲雙胍100 mg/kg陽性藥對照組和ACE100 mg/kg組，連續(xù)灌胃給藥4-5周后處死小鼠，留取血樣以及胰腺和腸道組織樣本，-80℃保存，測定GLP-1相關(guān)藥效和機(jī)制指標(biāo)。給藥期間采用快速血糖儀常規(guī)檢測小鼠血糖或口服葡萄糖耐量，評價藥物抗糖尿病藥效。
　　通

3、過血漿胰島素ELISA檢測、胰島組織HE染色、免疫熒光染色等方法探討藥物對胰島素分泌和胰島功能的影響，并采用ELISA、RT-PCR和免疫熒光法對血漿GLP-1水平、腸道GLP-1相關(guān)基因gcg、 pc3表達(dá)變化以及GLP-1原位表達(dá)水平進(jìn)行檢測，觀察藥物的抗糖尿病藥效及其對GLP-1表達(dá)和分泌的影響。
　　2.水菖蒲乙酸乙酯提取物基于GLP-1的體外效應(yīng)及分子機(jī)制研究
　　采用人腸道L細(xì)胞NCI-H716進(jìn)行體外培養(yǎng)，檢測

4、ACE在不同條件下對GLP-l表達(dá)與分泌的影響，并對其分子機(jī)制進(jìn)行深入研究。
　　基礎(chǔ)狀態(tài)下實驗方法:NCI-H716細(xì)胞分化兩天，加藥前更換為KRB緩沖液+0.2％ BSA，以1∶1000體積比給予DMSO、二甲雙胍MET(1 mM)或ACE(12.5μg/ml)，37℃孵育2h，收集上清液，加入50μg/ml蛋白酶抑制劑PMSF，于-80℃凍存待測;收取細(xì)胞以備后續(xù)機(jī)制研究。
　　病理狀態(tài)下實驗方法:其他條件均同基礎(chǔ)狀態(tài)

5、，在加藥前更換KRB+0.2％ BSA后，給予棕櫚酸(0.5 mM)造模并設(shè)立正常對照組，再以1∶1000體積比給予模型組DMSO、二甲雙胍MET(1 mM)或ACE(12.5μg/ml)，37℃孵育2h，收集上清液，加入50μg/ml PMSF，于-80℃凍存待測;收取細(xì)胞以備后續(xù)機(jī)制研究。
　　檢測方法如下:
　　(1)采用ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中GLP-1水平和細(xì)胞內(nèi)第二信使腺苷酸環(huán)化酶cAMP水平;
　

6、　(2)采用免疫熒光法檢測細(xì)胞內(nèi)GLP-1原位表達(dá);
　　(3)采用Lowery法檢測細(xì)胞蛋白濃度;
　　(4)采用核質(zhì)分離法分離細(xì)胞核蛋白與胞漿蛋白;
　　(5)采用Western blotting法檢測胰島素受體信號通路中關(guān)鍵蛋白水平，PKA及Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白。
　　實驗結(jié)果:
　　1.水菖蒲乙酸乙酯提取物對糖尿病動物體內(nèi)降糖作用的影響
　　(1) ACE對STZ誘導(dǎo)高血糖小

7、鼠的降糖作用
　　連續(xù)灌胃給藥4周后，與模型對照組比較，ACE降低小鼠禁食血糖的幅度為27.9％（P＜0.05），二甲雙胍陽性對照組的降低幅度為32.9％（P＜0.01）。
　　(2) ACE對db/db糖尿病小鼠的降糖作用
　　連續(xù)灌胃給藥5周，ACE可降低db/db糖尿病小鼠的禁食血糖，與模型對照組比較降低幅度為65.8％（P＜0.05），二甲雙胍陽性對照組的降低幅度為60.3％(P＜0.05)。
　　(3)

8、 ACE對DIO小鼠的降糖作用
　　連續(xù)灌胃4周，ACE可降低DIO小鼠的禁食和隨機(jī)血糖，降低幅度分別是15.0％(P＜0.05)和12.7％（P＜0.01），同時還可改善其口服葡萄糖耐量。給藥4周后糖耐量曲線下面積AUC比模型對照組降低19.4％(P＜0.05)。上述作用強(qiáng)度與陽性藥二甲雙胍相似。
　　2.水菖蒲乙酸乙酯提取物對糖尿病動物血漿胰島素水平及胰島組織的影響
　　ACE可升高STZ高血糖小鼠、db/db糖尿

9、病小鼠和DIO小鼠的血漿胰島素水平，與模型對照組比較的升高幅度分別為43.7％（P＜0.01）、53.1％（P＜0.001）和77.1％（P＜0.001）。ACE可增加STZ高血糖小鼠的胰島素原位表達(dá)，并使胰島組織體積增大，邊緣清晰;能改善db/db小鼠的胰島組織病理形態(tài);并可增加DIO小鼠胰島素和Ki67在胰島組織的原位表達(dá)，提示其具有促進(jìn)胰島β細(xì)胞增殖作用。
　　3.水菖蒲乙酸乙酯提取物對糖尿病動物GLP-1分泌和表達(dá)的影響<

10、br>　　ACE可增加STZ高血糖小鼠、db/db糖尿病小鼠和DIO小鼠的血漿GLP-1水平;并可促進(jìn)db/db小鼠和DIO小鼠GLP-1在腸道的原位表達(dá);促進(jìn)STZ小鼠和DIO小鼠的腸道GLP-1相關(guān)基因gcg和pc3表達(dá)，促進(jìn)db/db小鼠的pc3表達(dá)水平。
　　4.水菖蒲乙酸乙酯提取物在基礎(chǔ)狀態(tài)下對腸道L細(xì)胞GLP-1表達(dá)與分泌的影響及其分子機(jī)制
　　在基礎(chǔ)狀態(tài)下，ACE可增加腸道L細(xì)胞NCI-H716細(xì)胞內(nèi)GLP-1

11、相關(guān)基因gcg和pc3的表達(dá)，同時還可增加細(xì)胞上清液內(nèi)GLP-1水平，提示其具有促進(jìn)GLP-1表達(dá)與分泌的作用。此外，這一過程伴隨著胰島素受體信號通路關(guān)鍵蛋白胰島素受體底物1（IRS-1）酪氨酸989位點的磷酸化水平增高及其下游蛋白激酶B(PKB/Akt)絲氨酸473與蘇氨酸308位點磷酸化的增強(qiáng)。同時，ACE可增加細(xì)胞內(nèi)第二信使環(huán)磷酸腺苷(cAMP)水平，增加下游蛋白激酶A（PKA）磷酸化水平，以及增加Wnt信號通路關(guān)鍵蛋白β-cat

12、enin在核內(nèi)的蛋白水平、減少胞漿內(nèi)水平，并增加該信號通路下游靶基因Cyclin D蛋白水平。
　　5.水菖蒲乙酸乙酯提取物在病理狀態(tài)下對腸道L細(xì)胞GLP-1表達(dá)與分泌的影響及其分子機(jī)制
　　棕櫚酸處理NCI-H716細(xì)胞可明顯減少細(xì)胞上清液中GLP-1含量，同時減少cAMP含量，抑制PKA磷酸化，以及減少核內(nèi)β-catenin水平，造成胞漿內(nèi)β-catenin聚集，但對胰島素受體信號通路關(guān)鍵蛋白IRS-1和Akt的磷酸化無

13、明顯影響。ACE可明顯增加上清液中GLP-1含量，并增加細(xì)胞內(nèi)cAMP水平，伴隨著下游激酶PKA磷酸化水平和NCI-H716細(xì)胞核內(nèi)β-catenin蛋白水平的升高，提示其發(fā)生核轉(zhuǎn)位。ACE對胰島素受體信號通路的關(guān)鍵蛋白IRS-1和Akt的磷酸化水平無明顯影響。實驗結(jié)論
　　水菖蒲抗糖尿病有效提取部位乙酸乙酯提取物(ACE)在體內(nèi)外均具有促進(jìn)GLP-1表達(dá)與分泌的作用，其作用機(jī)制與cAMP/PKA信號通路和Wnt信號通路密切相關(guān)。

14、
　　(1)在體內(nèi)，ACE可降低鏈脲佐菌素(STZ)誘發(fā)高血糖小鼠、db/db高血糖小鼠、飲食誘導(dǎo)肥胖(DIO)小鼠的禁食血糖，并能改善DIO小鼠的隨機(jī)血糖和口服糖耐量。同時可增加STZ、db/db、DIO小鼠血漿胰島素水平，對胰島組織具有潛在保護(hù)作用，這可能與其增加腸道GLP-1相關(guān)基因gcg和pc3表達(dá)和血漿GLP-1水平有關(guān)。
　　(2)在體外，ACE在基礎(chǔ)狀態(tài)下可促進(jìn)腸道NCI-H716細(xì)胞表達(dá)與分泌GLP-1，其分