COX-2熒光探針的合成及其對肝細胞肝癌診斷作用的研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌在全世界每年的新發(fā)病例大約為70萬例，目前已經(jīng)成為一種嚴重影響生命健康的惡性腫瘤。原發(fā)性肝癌主要包括肝細胞性肝癌、膽管細胞癌、肝母細胞瘤和肝血管肉瘤。其中，肝細胞肝癌所占的比例最高，占原發(fā)性肝癌的80％以上。在亞洲特別是中國的肝癌發(fā)病率明顯高于世界平均水平，有報道指出，全世界的肝癌患者50％以上集中在中國。肝細胞性肝癌發(fā)病的主要危險因素有:肝炎病毒感染(在我國主要為乙型肝炎病毒感染)、大量飲酒、長期攝入黃曲霉素污染的食物、肥胖

2、、吸煙、脂肪肝、糖尿病等等。在不同的國家和地區(qū)，肝細胞肝癌的主要危險因素往往不盡相同，以上種種均對肝癌的臨床診斷、治療以及患者的預后造成影響。據(jù)文獻報道，目前我國肝細胞肝癌的死亡率已經(jīng)占到我國所有癌癥的18.8％。到目前為止，肝癌的標準治療措施仍然是以手術(shù)為主的綜合治療，且手術(shù)切除被認為是早期肝癌患者的首選的且最有效的治療措施，術(shù)后患者的5年生存率可以達到60％-70％，有些患者甚至可以達到根治的效果。隨著術(shù)前影像學及實驗室檢查技術(shù)的進

3、步，肝癌患者的術(shù)前評估如child-pugh肝功能評級、吲哚菁綠清除實驗(ICG15)及肝靜脈壓力梯度等檢測更加完善。隨著醫(yī)療技術(shù)及醫(yī)療器械的創(chuàng)新及進步，如超聲刀、氬氣刀、區(qū)域肝血流阻斷等技術(shù)的不斷發(fā)展，對肝臟本身解剖結(jié)構(gòu)的重新認識和臨床醫(yī)生手術(shù)水平的提高，肝癌患者的圍手術(shù)期死亡率明顯下降，一些大的醫(yī)療中心可以將死亡率控制在1％-5％。然而，肝癌患者的長期預后仍然達不到滿意的效果。導致肝細胞肝癌預后不良的因素有很多:早期沒有明確的臨床癥

4、狀，發(fā)生臨床癥狀就醫(yī)時往往已發(fā)展到進展期、對放化療等腫瘤治療手段不敏感、腫瘤手術(shù)切除后復發(fā)率高及往往較早出現(xiàn)的多部位、多器官轉(zhuǎn)移等等。在這些原因當中，肝癌手術(shù)過程中原發(fā)灶的殘留及轉(zhuǎn)移灶未得到足夠的清除是肝癌切除術(shù)后復發(fā)的最常見原因。肝癌的術(shù)后復發(fā)已經(jīng)嚴重影響到肝癌患者的治療效果及預后。然而，目前對這兩方面的判斷往往需要腫瘤達到一定體積且周邊組織出現(xiàn)明顯的轉(zhuǎn)移灶后才能得到明確的判斷，且這種判斷往往需要根據(jù)臨床醫(yī)生的經(jīng)驗來完成。怎樣找到一種

5、能夠讓臨床醫(yī)生更直觀、準確的判定腫瘤存在及手術(shù)切除范圍的方法，是廣大科研人員及臨床工作者的迫切需求，也是本實驗想解決的問題。
　　隨著人們對熒光現(xiàn)象的不斷認識及各種特異性熒光染料的不斷發(fā)展，熒光識別檢測技術(shù)在生命科學研究領(lǐng)域中的應(yīng)用日益廣泛。對生物體內(nèi)某些細胞或是細胞器所存在或表達的某些特異性指標進行識別，并將這些生物體內(nèi)的微觀信號通過某種手段轉(zhuǎn)化成可被儀器或人所直接識別的宏觀信號的方法及過程稱為生物識別?？梢杂糜谏镒R別的一類與

6、細胞生長、分化、增值、變性、凋亡的一類特征性生物產(chǎn)物被稱為生物標志物。在生物學的研究領(lǐng)域上，生物標志物被廣泛應(yīng)用于細胞學、腫瘤學、生物代謝等相關(guān)領(lǐng)域。因其生理特性和其微觀性的表現(xiàn)方式，生物標志物具有高準確性及高敏感性的特點，可以在生物學行為改變的早期，未表現(xiàn)出明顯宏觀變化時對這種改變做出反應(yīng)。通過某些特殊的設(shè)備和技術(shù)，可以將生物標志物發(fā)生的微觀變化形成可被觀測到的現(xiàn)象，從而達到對生物分子的識別，特異性疾病的診斷以及針對某些靶相位點進行生

7、物學治療的目的。其中，生物識別技術(shù)與熒光顯色技術(shù)相結(jié)合既構(gòu)成熒光探針技術(shù)。
　　熒光探針(fluorescence probe)指在紫外-可見-近紅外區(qū)有特征熒光，并且其熒光性質(zhì)(激發(fā)和發(fā)射波長、強度、壽命、偏振等)可隨所處環(huán)境的性質(zhì)，如極性、折射率、粘度等改變而靈敏地改變的一類熒光性分子。目前，在生物研究中，常利用熒光探針與核酸(DNA/RNA)、蛋白質(zhì)或其他大分子結(jié)構(gòu)發(fā)生非共價相互作用，使其熒光性質(zhì)發(fā)生改變，發(fā)出特異性熒光，通

8、過檢測這些熒光信號，達到檢測生物體中某種物質(zhì)變化的目的。
　　COX-2是環(huán)氧合酶的誘發(fā)性亞形，在正常組織中很少表達或不表達，在受到炎癥、腫瘤等外界刺激時發(fā)生高表達。目前，已發(fā)現(xiàn)COX-2在胃癌、肝癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤中表達升高，并有多項研究證明COX-2與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等生物學行為均具有密切的關(guān)系。因為COX-2的這一特點，我們考慮將其作為腫瘤的生物標志物用于腫瘤的檢測與識別。
　　本實驗應(yīng)用熒光探針標

9、記肝臟腫瘤組織中高表達而在正常肝組織中不表達的生物標記物COX-2，使其發(fā)出可見光波長范圍內(nèi)并可被儀器及肉眼識別的熒光，達到鑒別腫瘤的目的。從而為肝細胞肝癌的生物學研究、實驗診斷、術(shù)中肝癌原發(fā)灶的判定及轉(zhuǎn)移灶的鑒別提供一種新的思路與方法。
　　目的:
　　合成可以靶向到COX-2的熒光探針并應(yīng)用其對肝癌細胞、組織和動物模型進行熒光染色，探討其在臨床上的應(yīng)用價值。
　　方法:
　　1.應(yīng)用熒光基團和COX-2識別基

10、團合成熒光探針。
　　2.對熒光探針X進行了光穩(wěn)定性、COX-2識別特異性等性質(zhì)的測定。
　　3.應(yīng)用western blot技術(shù)驗證人肝癌細胞SMMC7721、BEL7402及正常肝細胞LO2中的COX-2蛋白表達情況。
　　4.應(yīng)用熒光探針X對上述細胞進行熒光染色。
　　5.驗證了熒光探針是通過靶向到COX-2蛋白后形成的腫瘤細胞熒光顯色。
　　6.驗證了熒光探針的細胞毒性。
　　7.制作了裸鼠人

11、肝癌細胞皮下轉(zhuǎn)移瘤模型并對其進行了活體熒光染色。
　　8.對手術(shù)切除的人肝癌組織和正常肝組織進行了對比熒光染色。
　　結(jié)果:
　　1.合成的熒光探針X能通過結(jié)合COX-2蛋白產(chǎn)生熒光，光學穩(wěn)定性良好。
　　2.人肝癌細胞SMMC7721、BEL7402可被熒光探針X進行熒光顯色，且western blot技術(shù)證實其高表達COX-2。
　　3.熒光探針可以實現(xiàn)對肝癌細胞及正常肝細胞的熒光區(qū)分。
　　4.

12、熒光探針對肝癌細胞及正常肝細胞的熒光區(qū)分是通過特異性結(jié)合COX-2實現(xiàn)的。
　　5.熒光探針在細胞學實驗中未見明顯細胞毒性。
　　6.熒光探針可對裸鼠的人肝癌皮下轉(zhuǎn)移瘤形成熒光染色。
　　7.熒光探針能夠?qū)κ中g(shù)切除的肝癌組織和正常肝組織進行熒光區(qū)分。
　　結(jié)論:
　　合成的熒光探針X可以通過靶向到COX-2蛋白從而對肝癌細胞、肝癌組織及裸鼠人肝癌細胞皮下轉(zhuǎn)移瘤產(chǎn)生熒光現(xiàn)象并能與正常肝細胞和組織區(qū)分，有進一步