氯化鋰聯(lián)合hUC-MSCs移植對阿爾茨海默鼠的干預(yù)作用.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimer’sdisease，AD)是一種與年齡直接相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其病因及發(fā)病的分子機(jī)制目前還不完全清楚，目前的治療方法只能改善癥狀，延緩病情進(jìn)展。神經(jīng)干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)為AD的治療提供了新的思路。有效激活內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞和采用外源性干細(xì)胞移植以替代和修復(fù)受損的神經(jīng)元是治療AD的兩大策略。但干細(xì)胞在體內(nèi)生長和體外培養(yǎng)的過程中都會出現(xiàn)衰老現(xiàn)象，進(jìn)而導(dǎo)致衰老相關(guān)疾病的發(fā)生和干細(xì)胞的應(yīng)用受限。
　　Wnt/β

2、-catenin信號通路在胚胎生長發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用。報道顯示激活Wnt/β-catenin信號通路可以促進(jìn)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化，調(diào)節(jié)體內(nèi)海馬部位的神經(jīng)發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞對阿爾茨海默鼠海馬神經(jīng)發(fā)生和神經(jīng)分化的促進(jìn)作用可能是通過激活Wnt/β-catenin信號通路實現(xiàn)的。氯化鋰（lithiumchloride，LiCl）作為治療雙相性情感障礙最重要的藥物，應(yīng)用于臨床已有100余年的歷史，其安全性和有效性已得到有效證實。同時

3、，LiCl是Wnt/β-catenin信號通路的關(guān)鍵蛋白糖原合成激酶-3β（glycogensynthasekinase-3β，GSK-3β）的直接抑制劑，可以使β-catenin在細(xì)胞核內(nèi)聚集，從而激活Wnt/β-catenin通路。研究發(fā)現(xiàn)LiCl可以改善阿爾茨海默鼠的空間記憶能力和神經(jīng)退行性病變。而LiCl聯(lián)合干細(xì)胞對阿爾茨海默病的治療作用目前尚未見報道。
　　目的：
　　因此，本課題以LiCl為靶點，以人臍帶來源的間

4、充質(zhì)干細(xì)胞（humanumbilicalcordderivedmesenchymalstemcells，hUC-MSCs）為對象，體外觀察LiCl對hUC-MSCs增殖、衰老、凋亡以及神經(jīng)分化能力的影響，然后通過體內(nèi)實驗評價LiCl聯(lián)合hUC-MSCs對AD鼠的神經(jīng)修復(fù)和干預(yù)作用，并初步探討其可能的分子機(jī)制，以期提高干細(xì)胞對AD的治療效果，為AD的治療提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　1、體外實驗研究LiCl對hUC-MSCs

5、增殖、衰老和神經(jīng)分化的影響
　　實驗分為2組：對照組(MSCs組)和LiCl處理組（MSCs+LiCl組）。CCK-8實驗和EdU染色法檢測LiCl對hUC-MSCs增殖的影響；流式細(xì)胞術(shù)檢測LiCl對hUC-MSCs周期和凋亡的影響；β-半乳糖苷酶染色法檢測LiCl對hUC-MSCs衰老的影響；qRT-PCR和WesternBlot檢測LiCl對hUC-MSCs中衰老相關(guān)基因在mRNA和蛋白水平表達(dá)的影響；細(xì)胞免疫熒光法檢測神經(jīng)

6、誘導(dǎo)分化后NSE、DCX、β-IIITubulin的表達(dá)情況；qRT-PCR檢測神經(jīng)誘導(dǎo)分化后Ngn1、Ngn2、Mash1的表達(dá)情況。
　　2、體內(nèi)實驗分析LiCl聯(lián)合hUC-MSCs移植對AD鼠的干預(yù)作用
　　取60只4月齡AD模型鼠（APP695v717轉(zhuǎn)基因小鼠），分為6組：對照組（APP-組），AD模型組(APP+組)、LiCl腹腔注射組（LiCl組）、hUC-MSCs移植組（MSCs組）、LiCl預(yù)處理hUC-M

7、SCs移植組（LiCl預(yù)組）LiCl聯(lián)合hUC-MSCs移植組（LiCl+MSCs組）。Morris水迷宮法檢測小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力；取出小鼠腦組織做石蠟切片，免疫組化檢測腦內(nèi)hUC-MSCs的存活和遷移，分析腦內(nèi)神經(jīng)元標(biāo)記物β-IIITubulin的表達(dá)，以及磷酸化tau蛋白的變化情況；分離小鼠海馬組織，qRT-PCR、WesternBlot檢測海馬組織中Wnt/β-catenin通路相關(guān)基因以及衰老相關(guān)基因的表達(dá)情況，qRT-PCR檢

8、測海馬組織內(nèi)神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF、NGF、NT3的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　1、與對照組相比，LiCl處理可以明顯促進(jìn)hUC-MSCs的增殖，增加處于S期的細(xì)胞比例、降低凋亡細(xì)胞比率和β-半乳糖苷酶陽性細(xì)胞比例（P<0.05）。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)LiCl可以降低hUC-MSCs中GSK-3β、p16、p21和p53在mRNA和蛋白水平的表達(dá)，增加c-Myc、pCNA、sirt1和sirt2在mRNA和蛋白水平的表達(dá)，而僅僅增加

9、β-catenin蛋白的表達(dá)（P均<0.05）。與hUC-MSCs相比，神經(jīng)誘導(dǎo)分化后細(xì)胞胞體明顯回縮，多數(shù)細(xì)胞可見樹突及軸突長出；誘導(dǎo)分化組中NSE、DCX、β-IIITubulin、Ngn2、Mash1的表達(dá)明顯增加（P<0.05），而與單純誘導(dǎo)組相比，LiCl處理組的各評價指標(biāo)均有增加（P<0.05）。
　　2、與APP+組相比，hUC-MSCs移植和LiCl腹腔注射均能明顯改善小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能，二者聯(lián)合時效果更佳（P＜0

10、.05）。與MSCs組相比，LiCl+MSCs組海馬內(nèi)hUC-MSCs的存活明顯增加（P＜0.05）。各治療組海馬組織中衰老相關(guān)基因p16、p21、p53在mRNA和蛋白水平的表達(dá)均明顯下降，pCNA、sirt1、sirt2在mRNA和蛋白水平的表達(dá)明顯增加；其中，聯(lián)合治療組sirt1在mRNA和蛋白水平表達(dá)明顯高于單一治療組（P＜0.05）。各治療組Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)基因GSK-3β均有下降、β-catenin、c

11、-Myc均有升高，且c-Myc在聯(lián)合治療組升高更加明顯（P＜0.05）。各治療組β-IIITubulin、BDNF、NGF、NT3的表達(dá)均明顯增加（P＜0.05），其中聯(lián)合治療組增加最為明顯（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1、LiCl可通過激活Wnt/β-catenin信號通路和調(diào)控hUC-MSCs中衰老相關(guān)基因的表達(dá)促進(jìn)hUC-MSCs的增殖，抑制hUC-MSCs的凋亡與衰老，促進(jìn)hUC-MSCs的神經(jīng)分化，進(jìn)而增加干