紅景天苷對(duì)海人藻酸致癇小鼠的神經(jīng)保護(hù)作用及其機(jī)制的探討.pdf

1、癲癇是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，可以反復(fù)發(fā)作，有很高的發(fā)病率和致死率。在世界范圍內(nèi)，有1％的人口受到癲癇的困擾，我國也有近1000萬癲癇患者，其中20%的患者會(huì)進(jìn)展為難治性癲癇。癲癇長(zhǎng)期反復(fù)發(fā)作可以引起認(rèn)知功能障礙，嚴(yán)重影響患者的生活，給家庭和社會(huì)造成很大負(fù)擔(dān)。目前，臨床上應(yīng)用抗癲癇藥物（Antiepileptic drugs，AEDs）來控制癲癇發(fā)作，但是AEDs藥物對(duì)三分之一的患者無效，甚至還會(huì)引起注意力下降、認(rèn)知功能障礙等副作用。因

2、此，急需尋找一種既能控制癲癇反復(fù)發(fā)作，又能改善患者認(rèn)知功能障礙的藥物。
　　海人藻酸（Kainic acid，KA)是一種谷氨酸的同系物，可以激活谷氨酸受體，引起神經(jīng)元損傷。高劑量的KA單次給藥可以誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的癲癇持續(xù)狀態(tài)（Status epileptics，SE）發(fā)作，而SE會(huì)誘發(fā)自發(fā)性反復(fù)癲癇發(fā)作（Spontaneous recurrent seizures，SRS），這一過程類似于人類癲癇的發(fā)病過程，因此，該模型作為經(jīng)典的

3、癲癇在體動(dòng)物模型被廣泛應(yīng)用于癲癇的研究。在海馬神經(jīng)元中，無 Mg2+細(xì)胞外液可以誘導(dǎo)神經(jīng)元穩(wěn)定持久放電，而神經(jīng)元反復(fù)異常的放電可以造成細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變，引起突觸重構(gòu)，最終形成異常的神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)，該細(xì)胞模型模擬了人類癲癇發(fā)作時(shí)神經(jīng)元異常放電的過程，是比較成熟的癲癇離體模型。
　　癲癇的發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明，但一些重要的發(fā)病環(huán)節(jié)已為人類所知。目前，有幾種學(xué)說受到研究者們的關(guān)注，包括離子通道、谷氨酸誘導(dǎo)的興奮性神經(jīng)毒、神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)、細(xì)胞凋亡

4、和氧化應(yīng)激等。氧化應(yīng)激可以引起活性氧（Reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生過多，造成機(jī)體內(nèi)源性的自由基和抗氧化酶失衡，引起細(xì)胞損傷。過多的ROS可以氧化DNA，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的異常表達(dá)，誘發(fā)神經(jīng)元凋亡導(dǎo)致癲癇發(fā)作。因此，抗氧化劑在治療癲癇方面有重要作用。
　　紅景天是生長(zhǎng)于高海拔地區(qū)的植物，在我國主要分布于西藏。紅景天苷（Salidroside，SDS）是從紅景天的根莖中提取的主要活性成分。SDS有多

5、種生物學(xué)活性，包括耐受缺氧、抗衰老、抑制腫瘤生長(zhǎng)、消除炎癥、緩解疲勞以及心血管保護(hù)效應(yīng)。近些年發(fā)現(xiàn)，SDS可以迅速通過血腦屏障（Blood brain barrier，BBB），對(duì)腦缺血、血管性癡呆、阿爾茲海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）有治療作用。此外，SDS還可以改善低氧引起的大鼠學(xué)習(xí)記憶功能損傷，減輕腦缺血、AD、衰老誘發(fā)的認(rèn)知功能障礙。然而，SDS在癲癇中的作用尚未見相關(guān)報(bào)道。因此，本研究利用KA建立的小鼠

6、SE模型，從在體水平觀察了SDS對(duì)癲癇引起腦損傷的保護(hù)效應(yīng)；利用無Mg2+細(xì)胞外液誘導(dǎo)的癲癇細(xì)胞模型，從離體水平探討了SDS發(fā)揮保護(hù)作用可能的分子機(jī)制。本研究由以下三部分組成。
　　第一部分紅景天苷對(duì)海人藻酸誘導(dǎo)的小鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)的保護(hù)作用
　　目的：建立KA誘導(dǎo)的小鼠SE模型，觀察SDS預(yù)處理對(duì)癲癇發(fā)作、腦電圖以及氧化應(yīng)激損傷的作用。
　　方法：將雄性8-10周的C57BL/6小鼠隨機(jī)分為6組，對(duì)照組35只，其余各組

7、56只。對(duì)照組（Con）：腹腔給予0.9%無菌生理鹽水；KA組：KA溶于0.9%無菌生理鹽水，腹腔給予30 mg/kg的KA；SDS25 mg/kg+KA組：SDS溶于0.9%無菌生理鹽水，在注射KA前1 h給予25 mg/kg SDS；SDS50 mg/kg+KA：在注射KA前1 h給予50 mg/kg SDS；Vehicle+KA組：在注射KA前1 h給予0.9%無菌生理鹽水；50 mg/kg SDS組：在0.9%無菌生理鹽水注射前

8、1 h給予50 mg/kg SDS。在注射KA后2 h，觀察各組小鼠SE潛伏期、SE發(fā)生率以及腦電圖改變，依據(jù)Racine行為分級(jí)法，小鼠癲癇發(fā)作達(dá)到4級(jí)，持續(xù)時(shí)間至少30 min認(rèn)為是達(dá)到SE。此外，在注射KA后15 min、45 min、3 h、6 h、12 h、24 h和48 h分別取小鼠海馬組織檢測(cè)丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量、超氧化物歧化酶（Super oxide dismutase，SOD）活性、還原

9、型谷胱甘肽（Reduced glutathione，GSH）含量。
　　結(jié)果：1在注射KA后2 h，有90%的小鼠存活，有80%的小鼠成功誘發(fā)SE。與KA組小鼠相比，SDS預(yù)處理可以延長(zhǎng)SE發(fā)作的潛伏期（P<0.05），減少SE的發(fā)病率（P<0.05），增加小鼠的存活率，并且高濃度的SDS（50 mg/kg）比低濃度的SDS（25 mg/kg）有更明顯的保護(hù)效應(yīng)（P<0.05）。Con組和SDS組小鼠均無癲癇發(fā)作，Vehicle+

10、 KA組和KA組相比，小鼠SE發(fā)作程度和潛伏期無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。2 MDA含量：與Con組相比，小鼠海馬組織MDA含量在注射KA后15 min開始增加，在45 min達(dá)到峰值，之后隨著時(shí)間推移，MDA含量有所下降，但仍高于相同時(shí)間點(diǎn)的 Con組（P<0.05）；SDS預(yù)處理可以明顯減少KA組小鼠海馬中MDA含量（P<0.05），并且SDS50 mg/kg組中MDA含量低于SDS25 mg/kg組（P<0.05）；與KA組相比

11、，Vehicle+KA組小鼠海馬組織中MDA含量無明顯改變（P>0.05）。3 SOD活性：給予KA后15 min，小鼠海馬組織的SOD活性開始下降，在45 min時(shí)達(dá)到最低值（P<0.05），之后有所增加，但仍低于相同時(shí)間點(diǎn)Con組小鼠的SOD活性（P<0.05）。與KA組相比，SDS預(yù)處理可以增加SOD活性（P<0.05），并且50 mg/kg濃度的SDS組使其增加更明顯（P<0.05）；與KA組相比，Vehicle+KA組小鼠海馬

12、組織中SOD活性無明顯變化（P>0.05）。4 GSH含量：不同實(shí)驗(yàn)組中小鼠海馬組織GSH的改變趨勢(shì)與SOD相似， KA可以減少GSH含量，并且在45 min時(shí)減少最明顯（P<0.05），而SDS預(yù)處理可以增加GSH含量（P<0.05），并且50 mg/kg濃度的SDS使其增加更明顯（P<0.05）；Vehicle+KA組小鼠海馬組織中GSH的含量與KA組相比則無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。
　　第二部分紅景天苷對(duì)海人藻酸致癇小鼠

13、認(rèn)知功能障礙的保護(hù)作用
　　目的：利用KA建立小鼠SE模型，觀察SDS對(duì)SRS發(fā)作、認(rèn)知功能障礙和海馬神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用。
　　方法：本研究中共56只小鼠，其中10只小鼠作為對(duì)照組（Con）每天腹腔注射0.9%無菌生理鹽水，剩余46只小鼠腹腔給予30 mg/kg的KA誘導(dǎo)SE發(fā)作。依據(jù)Racine行為分級(jí)法，小鼠癲癇發(fā)作達(dá)到4級(jí)，持續(xù)時(shí)間至少30 min認(rèn)為是達(dá)到SE，成功誘導(dǎo)的SE小鼠納入后續(xù)實(shí)驗(yàn)。46只小鼠在注射KA后

14、2 h，41只存活，其中36只小鼠達(dá)到SE發(fā)作，將其隨機(jī)分為4組，每組9只。KA組：KA溶于0.9%無菌生理鹽水，腹腔給予30 mg/kg的KA；KA+SDS5 mg/kg組：SDS溶于0.9%無菌生理鹽水，在注射 KA后第二天開始每天腹腔給予5 mg/kg SDS，連續(xù)給藥14天；KA+SDS10 mg/kg組：從注射KA后第二天開始每天腹腔給予10 mg/kg SDS，連續(xù)給藥14天；KA+Vehicle組：從注射KA后第二天開始每

15、天腹腔給予0.9%生理鹽水，連續(xù)給藥14天。同時(shí)，用V-EEG連續(xù)記錄小鼠SRS發(fā)作情況。14天后用Morris水迷宮檢測(cè)小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力；用Nissl染色觀察海馬CA1、CA3區(qū)存活神經(jīng)元的形態(tài)和數(shù)目。
　　結(jié)果：1 Con組小鼠無癲癇發(fā)作；46只小鼠注射KA后，存活率為89.13%，SE發(fā)生率為78.26%。V-EEG結(jié)果顯示，與KA組相比，KA+SDS5 mg/kg組和KA+SDS10 mg/kg組中SRS每次發(fā)作持續(xù)

16、時(shí)間明顯縮短（P<0.05），并且高濃度SDS組中SRS發(fā)作時(shí)間更短（P<0.05）。KA+SDS5 mg/kg組和KA+SDS10 mg/kg組SRS發(fā)作嚴(yán)重程度、發(fā)作頻率均較KA組明顯降低（P<0.05）。KA+Vehicle組和KA組相比，SRS發(fā)作持續(xù)時(shí)間、嚴(yán)重程度和頻率均無顯著差異（P>0.05）。2 Morris水迷宮：在定位航行實(shí)驗(yàn)中，隨著訓(xùn)練時(shí)間增加，各組小鼠的逃逸潛伏期均縮短。從訓(xùn)練第二天開始，不同實(shí)驗(yàn)組小鼠的逃逸潛伏

17、期出現(xiàn)差異：與Con組相比， KA組小鼠逃逸潛伏期明顯延長(zhǎng)（P<0.05）；KA+SDS5 mg/kg組和KA+SDS10 mg/kg組小鼠逃逸潛伏期較KA組明顯縮短（P<0.05）?？臻g探索實(shí)驗(yàn)中，小鼠穿越平臺(tái)次數(shù)有顯著差異：與Con組相比，KA組小鼠穿越平臺(tái)的次數(shù)減少（P<0.05）；SDS治療組較KA組次數(shù)增多（P<0.05），并且KA+SDS10 mg/kg組多于KA+SDS5 mg/kg組（P<0.05）。KA組小鼠在目標(biāo)象限

18、逗留的時(shí)間比Con組明顯縮短（P<0.05），KA+SDS5 mg/kg、KA+SDS10 mg/kg組小鼠在目標(biāo)象限逗留的時(shí)間較KA組明顯延長(zhǎng)（P<0.05）。KA+Vehicle組與KA組相比，小鼠的逃逸潛伏期、穿越平臺(tái)次數(shù)和在目標(biāo)象限逗留的時(shí)間均無差異（P>0.05）?？梢娖脚_(tái)實(shí)驗(yàn)中，不同實(shí)驗(yàn)組小鼠的游泳速度、逃逸潛伏期均無顯著差別。3 Nissl染色：在Con組中，小鼠海馬CA1、CA3區(qū)神經(jīng)元無明顯丟失、結(jié)構(gòu)完整、胞漿內(nèi)Nis

19、sl小體豐富；在KA組中，神經(jīng)元出現(xiàn)明顯丟失、細(xì)胞核固縮，Nissl小體數(shù)量較Con組減少；KA+SDS5 mg/kg和KA+SDS10 mg/kg組神經(jīng)元結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，Nissl小體數(shù)量較KA組增加。KA組小鼠海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)的神經(jīng)元存活數(shù)量均較Con組明顯減少（P<0.05）；與KA組相比，KA+SDS5 mg/kg組和KA+SDS10 mg/kg組神經(jīng)元數(shù)量顯著增加（P<0.05），并且KA+SDS10 mg/kg組CA1、

20、CA3神經(jīng)元數(shù)量均高于KA+SDS5 mg/kg組（P<0.05）；KA+Vehicle組海馬神經(jīng)元存活數(shù)量與KA組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。
　　第三部分紅景天苷在癲癇細(xì)胞模型中的保護(hù)作用及其分子機(jī)制
　　目的：應(yīng)用無Mg2+細(xì)胞外液孵育小鼠海馬神經(jīng)元建立細(xì)胞癲癇模型，觀察SDS對(duì)癲癇細(xì)胞損傷的影響及其可能的作用機(jī)制
　　方法：利用出生24 h內(nèi)的小鼠分離出海馬神經(jīng)元，接種到培養(yǎng)基中，培養(yǎng)到第7天，將細(xì)胞隨機(jī)

21、分為8組：正常對(duì)照組（Con）：含有1 mmol/LMg2+的細(xì)胞外液，作用神經(jīng)元3 h后，更換為正常培養(yǎng)基；細(xì)胞模型組（Model）：不含Mg2+的細(xì)胞外液，作用3 h后，更換為正常培養(yǎng)基；SDS30μmol/L組：不含Mg2+的細(xì)胞外液，作用3 h后，加入含有SDS濃度為30μmol/L的培養(yǎng)基作用2 h，更換為正常培養(yǎng)基；SDS60μmol/L組：不含Mg2+的細(xì)胞外液，作用3 h后，加入60μmol/LSDS作用2 h后，更換為

22、正常培養(yǎng)基；SDS120μmol/L組：不含Mg2+的細(xì)胞外液孵育3 h后，加入120μmol/L SDS作用2 h，更換為正常培養(yǎng)基；Compound C組：不含Mg2+的細(xì)胞外液孵育3 h后，加入120μmol/LSDS作用2 h，再加入50μmol/L Compound C作用1 h，更換為正常培養(yǎng)基；Sirtinol組：不含Mg2+的細(xì)胞外液孵育3 h后，加入120μmol/LSDS作用2 h，再加入100μmol/L Siri

23、nol作用1 h，更換為正常培養(yǎng)基；Vehicle組：不含Mg2+的細(xì)胞外液孵育3 h后，加入和120μmol/L SDS相同體積的0.9%無菌生理鹽水作用2 h，更換為正常培養(yǎng)基。在各種藥物作用結(jié)束后24 h，采用CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力，LDH檢測(cè)細(xì)胞損傷程度，Calcein-AM/PI進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，Real-Time PCR檢測(cè)AMPK、SIRT1的mRNA水平，Western blot檢測(cè)AMPK、SI

24、RT1的蛋白表達(dá)，SIRT1去乙?；富钚苑治鰴z測(cè)SIRT1去乙酰化酶活性。
　　結(jié)果：1 CCK-8檢測(cè)：與Con組相比，癲癇細(xì)胞活力明顯下降（P<0.05）；建立癲癇細(xì)胞模型后，給予30μmol/L、60μmol/L、120μmol/L三個(gè)劑量的SDS，60μmol/LSDS組和120μmol/LSDS組細(xì)胞活力較癲癇細(xì)胞組增加，并且120μmol/LSDS組增加更明顯（P<0.05）；Vehicle組和癲癇細(xì)胞組相比細(xì)胞活力

25、無明顯改變（P>0.05）。2 LDH檢測(cè)：癲癇細(xì)胞LDH釋放量較Con組明顯增加（P<0.05），SDS可以抑制LDH的釋放，并且呈現(xiàn)劑量依賴性，120μmol/L濃度的SDS對(duì)LDH的釋放有更明顯的抑制作用（P<0.05）；與癲癇細(xì)胞組相比，Vehicle組細(xì)胞LDH活性無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。3 Calcein-AM/PI雙染：癲癇模型組細(xì)胞存活率較Con組明顯減少（P<0.05）；與癲癇模型組相比，SDS使細(xì)胞存活率顯著增

26、加（P<0.05）；Vehicle組和模型組相比，細(xì)胞存活率無明顯差異（P>0.05）。4細(xì)胞凋亡檢測(cè)：與Con組相比，癲癇細(xì)胞組細(xì)胞凋亡率明顯增加（P<0.05），SDS可以減少癲癇組細(xì)胞的凋亡率（P<0.05）；Compound C是AMPK（AMP-activated protein kinase，AMPK）抑制劑，Sirtinol為SIRT1（Silent information regulator1，SIRT1）酶活性抑制劑，

27、Compound C和Sirtinol可以抑制SDS對(duì)癲癇細(xì)胞凋亡的影響；Vehicle組和模型組相比，細(xì)胞凋亡率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（ P>0.05）。5 Real-Time PCR：與Con組相比，癲癇組細(xì)胞中AMPK的mRNA水平下調(diào)（P<0.05）；SDS組與癲癇細(xì)胞組相比，AMPK的mRNA水平上調(diào)（P<0.05）；Vehicle組和模型組AMPK的mRNA水平無差異。SIRT1的mRNA水平在各組間無明顯改變。6 Western b

28、lot：與Con組相比，癲癇模型組細(xì)胞AMPK的蛋白表達(dá)明顯減少（P<0.05）；SDS可以使模型組AMPK的表達(dá)增加（P<0.05）；Vehicle和模型組相比，AMPK的蛋白表達(dá)無明顯差異（P>0.05）。SIRT1的蛋白表達(dá)在各組間無明顯改變。7 SIRT1去乙?；富钚裕喊d癇細(xì)胞組SIRT1去乙?；富钚暂^Con組降低（P<0.05）；與模型組相比，SDS組SIRT1活性增加（P<0.05）；Compound C組SIRT1酶活

29、性較SDS組明顯降低（P<0.05）；Vehicle組與模型組相比，SIRT1酶活性無明顯差異（P>0.05）。
　　結(jié)論：
　　1在KA誘導(dǎo)的小鼠SE模型中，SDS預(yù)處理可能通過改善氧化應(yīng)激損傷而起到抑制SE發(fā)作的作用，并且在注射KA后45 min有最顯著作用。
　　2在KA誘導(dǎo)的小鼠SE模型中，SRS引起小鼠認(rèn)知功能障礙和海馬CA1、CA3區(qū)神經(jīng)元損傷；SDS后處理可以抑制SRS發(fā)作，并且可能通過減輕神經(jīng)元損傷而改