普通棉耳狨猴MHC-Ⅰ限制性等位基因抗原分子特征分析.pdf

1、目的:
　　此研究旨在揭示普通棉耳狨猴MHC-Ⅰ類和β2m基因的特征，闡明狨猴MHC-Ⅰ類蛋白的結(jié)構(gòu)特征，豐富狨猴的MHC-Ⅰ類分子背景資料，提高后續(xù)挑選狨猴作為實驗動物時的穩(wěn)定性和重復(fù)性，為后續(xù)了解狨猴對HCV特異性細(xì)胞免疫保護(hù)反應(yīng)的分子機制和疫苗免疫研究提供重要信息。
　　方法:
　　1、研究對象
　　普通棉耳狨猴common marmosets(Callithrix jacchus)3只，雄性，體重300-

2、400g左右/只。
　　2、實驗方法
　　(1)普通棉耳狨猴MHC-Ⅰ重鏈蛋白分子制備:采用RT-PCR技術(shù)從狨猴PBMC中擴增MHC-Ⅰ類等位基因全長，根據(jù)單倍型克隆數(shù)≥2的原則，確定能編碼完整蛋白的MHC-Ⅰ類等位基因。利用DNAMAN5.2.2軟件對等位基因的序列進(jìn)行綜合比對，并將等位基因的堿基序列翻譯為氨基酸序列后比對，利用MEGA4.1軟件制作系統(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)行狨猴等位基因分析。挑選出現(xiàn)頻率最高的等位基因，并在其羧基端

3、加上BSP基因后插入原核表達(dá)載體中進(jìn)行表達(dá)，SDS-PAGE、WB鑒定表達(dá)情況。鎳柱純化。
　　(2)普通棉耳狨猴MHC-Ⅰ輕鏈β2-microglobulin蛋白分子制備:采用RT-PCR技術(shù)從狨猴PBMC中擴增β2m的mRNA基因。用DNAMAN和DNAstar軟件對序列進(jìn)行分析，并與其他靈長類動物及不同物種的β2m進(jìn)行同源性比對、系統(tǒng)進(jìn)化分析。亞克隆β2m成熟肽基因，插入原核表達(dá)載體pET-28a(+)中，并通過SDS-PA

4、GE和WB鑒定其表達(dá)。鎳柱純化。
　　(3)普通棉耳狨猴MHC-Ⅰ-BSP和β2m成熟肽結(jié)構(gòu)分析及可溶性單體制備和鑒定:運用BioEdit和DNAstar對MHC-Ⅰ-BSP蛋白以及β2m成熟肽蛋白一級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，Protscale程序進(jìn)行蛋白疏水性分析，ANTHEPROT程序進(jìn)行蛋白質(zhì)理化特性分析，NetPHos2.0 Server進(jìn)行蛋白質(zhì)磷酸化位點分析。用圓二色譜、SOPMA和PredictProtein軟件對蛋白二級結(jié)構(gòu)

5、進(jìn)行預(yù)測。利用SWISS-MODEL程序?qū)Φ鞍走M(jìn)行同源建模分析。采用Altman首創(chuàng)的四聚體制備方法嘗試了狨猴MHC-Ⅰ/肽可溶性單體的制備。
　　結(jié)果:
　　(1)MHC-Ⅰ重鏈蛋白分子制備
　　從3只普通棉耳狨猴PBMC中克隆的MHC-Ⅰ類等位基因擴增產(chǎn)物全長為1100bp左右，共得到了116個MHC-Ⅰ等位基因克隆，根據(jù)單倍型克隆數(shù)≥2的原則，從中確定了7個能編碼為完整蛋白的Caja-G等位基因和1個假基因。新確

6、定的MHC-Ⅰ類等位基因均被劃分為Caja-G型等位基因。將序列翻譯為氨基酸序列后與人的HLA-G進(jìn)行比對，可見Caja-G等位基因序列呈現(xiàn)高度的多態(tài)性。狨猴MHC-Ⅰ類等位基因序列包含胞外段(α1-α3)，跨膜段和胞內(nèi)段，胞外段。遠(yuǎn)膜端α1、α2結(jié)構(gòu)域其氨基酸排列順序變化較大，共同構(gòu)成了抗原結(jié)合槽，是Ⅰ類分子多態(tài)性的基礎(chǔ)。近膜端的α3結(jié)構(gòu)域氨基酸序列較為保守。挑取了加上之前本課題組研究的總共12只狨猴中出現(xiàn)頻率最高的等位基因Caja-

7、G*09∶03作為需要表達(dá)的蛋白。Caja-G*09∶03攜帶率相對較高，預(yù)期Caja-G*09∶03構(gòu)建的四聚體具有較好的可行性和應(yīng)用前景。并通過PCR技術(shù)將BirA酶底物肽(BSP)基因連接到了Caja-G*09∶03胞外域的羧基端，Caja-G*09∶03胞外域-BSP插入原核表達(dá)載體pET-28a(+)中，鑒定其表達(dá)后進(jìn)行了條件優(yōu)化使其大量表達(dá)。Caja-G*09∶03-BSP(MHC-Ⅰ-BSP)蛋白分子大小約34kDa。包涵

8、體洗滌溶解后，SDS-PAGE結(jié)果顯示包涵體純度較純。由于缺乏針對狨猴Caja-G的單克隆抗體，此處采用針對His標(biāo)簽的抗體檢測蛋白表達(dá)。Western Blot顯示蛋白大小與SDS-PAGE一致。并用鎳柱對蛋白進(jìn)行了純化。
　　(2)MHC-Ⅰ輕鏈β2-microglobulin蛋白分子制備
　　克隆的β2m的mRNA基因全長為357bp，前20個氨基酸為信號肽部分，后99個氨基酸為成熟肽部分，與GenBank中普通棉耳狨

9、猴β2m的mRNA序列（XM_002753411.2）同源性為100％，證明了其高度保守性。亞克隆了β2m基因的成熟肽部分，將β2m基因的成熟肽基因插入原核表達(dá)載體pET-28a(+)中進(jìn)行蛋白表達(dá)。SDS-PAGE結(jié)果顯示蛋白大小約為12kDa，與理論預(yù)測值一致。采用針對狨猴β2m的單克隆抗體和His標(biāo)簽抗體對蛋白進(jìn)行了鑒定，分子大小一致，說明β2m正確表達(dá)。用鎳柱對蛋白進(jìn)行了純化。
　　(3)蛋白結(jié)構(gòu)分析及可溶性單體制備和鑒定

10、
　　普通棉耳狨猴MHC-Ⅰ-BSP蛋白（Caja-G*09∶03-BSP）和β2m成熟肽蛋白預(yù)測分子量分別為33.63KDa和11.60KDa。與之前原核表達(dá)的結(jié)果一致。其理論假設(shè)的等電點pI分別為5.085和7.355。MHC-Ⅰ-BSP蛋白疏水性為1.389，β2m成熟肽蛋白疏水性為1.122。棉耳狨猴MHC-Ⅰ-BSP蛋白存在著21個潛在的磷酸化位點，β2m蛋白8個潛在的磷酸化位點。SOPMA預(yù)測的MHC-I-BSP蛋白以

11、α-螺旋、β-折疊和隨機卷曲為主。PredictProtein預(yù)測的MHC-I-BSP蛋白α-螺旋占據(jù)22.3％，β-折疊為32.6％，其他結(jié)構(gòu)為45％。β2m成熟肽蛋白SOPMA預(yù)測的蛋白二級結(jié)構(gòu)主要以β-折疊和隨機卷曲為主，其中最主要的結(jié)構(gòu)元件為β-折疊，占43.43％，α-螺旋最少，僅4.04％。PredictProtein預(yù)測的結(jié)果與SOPMA結(jié)果基本一致，其不含α-螺旋，β-折疊比例為45.5％。圓二色譜儀(JASCO J-8

12、10)測定CD值與軟件預(yù)測存在較大的差異。蛋白同源建模分析顯示狨猴MHC-I-BSP蛋白的3D結(jié)構(gòu)與人的HLAⅠ的3D結(jié)構(gòu)相似，由2個反向平行的α螺旋和8個β片層組成，具有一個抗原結(jié)合槽。α3由7條β片層組成。β2m蛋白的3D結(jié)果與人的β2m蛋白的3D結(jié)構(gòu)類似，由7個β片層組成，無α螺旋。采用Altman首創(chuàng)的四聚體制備方法嘗試了狨猴MHC-Ⅰ/肽可溶性單體的制備，為進(jìn)一步制備MHC-Ⅰ/肽四聚體做準(zhǔn)備。選取前期實驗狨猴T細(xì)胞反應(yīng)檢測中

13、具有強反應(yīng)性的HCV E1(E1-282)和已報道的人HLA-A2優(yōu)勢表位肽NS3(CV9)構(gòu)建Caja-G*09∶03限制性的MHC-Ⅰ/肽可溶性單體，但折疊后復(fù)合物經(jīng)HPLC和ELISA鑒定后未發(fā)現(xiàn)有單體形成，在優(yōu)化反應(yīng)條件及改變濃縮方式、純化方法后均未發(fā)現(xiàn)單體形成。對此結(jié)果進(jìn)行了分析。
　　結(jié)論:
　　(1)利用RT-PCR技術(shù)從3只普通棉耳狨猴PBMC中擴增了MHC-Ⅰ類等位基因重鏈和β2m基因，并對加上之前本課題組

14、研究的總共12只狨猴的MHC-Ⅰ類等位基因序列進(jìn)行了詳細(xì)的分析，豐富了狨猴MHC-Ⅰ類等位基因遺傳背景。
　　(2)亞克隆了Caja-G*09∶03胞外域和β2m成熟肽基因，在Caja-G*09∶03胞外域羧基端連接上了BSP基因，使其羧基端可以成功標(biāo)記上生物素，為下一步構(gòu)建狨猴的MHC四聚體研究奠定了基礎(chǔ)。
　　(3)將狨猴Caja-G*09∶03胞外域-BSP基因和β2m成熟肽基因連接至pET-28a(+)原核表達(dá)系統(tǒng)，

15、進(jìn)行了原核表達(dá)并對其表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化，蛋白以包涵體的形式進(jìn)行了高效表達(dá)。并用鎳柱進(jìn)行了純化。
　　(4)運用測序所得基因序列推導(dǎo)的氨基酸序列和生物信息學(xué)軟件、圓二色譜(CD)對狨猴Caja-G*09∶03胞外域-BSP基因和β2m成熟肽的一級結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，并運用同源建模構(gòu)建了狨猴Caja-G*09∶03胞外域-BSP基因和β2m成熟肽蛋白的三級結(jié)構(gòu)(3D)模型。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析為狨猴HCV/GBV-B嵌合病毒模型CD8+