以VEGFR-2為抗原肽的MHC-Ⅰ類分子-抗原肽單鏈三聚體的構(gòu)建.pdf

1、在機(jī)體抗腫瘤免疫中,特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答在控制早期腫瘤細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移中有重要作用,尤其是CD8<'+>CTL,它可識別腫瘤細(xì)胞表面被MHC-I類分子提呈的抗原肽,從而殺傷腫瘤細(xì)胞.將編碼MHC-I類分子的重鏈、β2微球蛋白(β2microglobulin,β2m)及腫瘤相關(guān)抗原肽的DNA序列,用接頭(linker)相連接,并折疊形成MHC-I類分子一抗原肽單鏈三聚體(single-chain trimer,SCT).用該三聚體來研制的抗腫

2、瘤DNA疫苗能有效地維持其共價(jià)結(jié)構(gòu),并可以穩(wěn)定地將抗原肽提呈在細(xì)胞表面,有效地激活抗原特異性的CD8<'+>CTL,從而能更有效地殺傷、清除惡性腫瘤細(xì)胞,發(fā)揮抗腫瘤作用. 研究發(fā)現(xiàn),惡性腫瘤的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移必須依靠腫瘤新生血管提供足夠的營養(yǎng),腫瘤血管生成抑制策略就是一種以阻止和減少腫瘤組織血管生成為目的的治療方法.該治療策略有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn),具有一定的廣譜性,且不易產(chǎn)生耐藥性,相對于細(xì)胞毒性藥物具有較高的特異性.血管內(nèi)皮生長因子

3、(vascular endothelialgrowth factor,VEGF)與表達(dá)在血管內(nèi)皮細(xì)胞上的相應(yīng)受體VEGFR-2(Vascularendothelial growth factor receptor 2),又稱為KDR(kinase insert domain-containingreceptor)結(jié)合所引起的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是血管生成中的限速步驟,在整個(gè)血管生成中發(fā)揮著關(guān)鍵作用.因此,VEGF及其受體VEGFR-2成為腫瘤血管生

4、成抑制策略的重要靶點(diǎn).若能通過某種途徑打破對VEGFR-2的自身免疫耐受,誘導(dǎo)產(chǎn)生針對VEGFR-2的免疫應(yīng)答,破壞表達(dá)VEGFR-2的血管內(nèi)皮細(xì)胞,無疑是抗腫瘤血管生成治療最經(jīng)濟(jì)、最有效的方法. 迄今,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)三種H-2D<'b>限制性的KDR表位,即KDRl、KDR2和KDR3.其中KDR2與H-2D<'b>親和力最高,且最易被提呈到細(xì)胞表面,從而更有效打破自身免疫耐受,誘導(dǎo)CD8<'+>CTL應(yīng)答,對內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生殺傷作用.

5、因此,選擇KDR2Qin Liu,Institute.of Immunology,Zhejiang University,Hangzhou,310058作為抗腫瘤血管生成治療的靶點(diǎn)較其他表位更為理想.本課題旨在構(gòu)建表達(dá)小鼠VEGFR-2抗原肽的SCT,為進(jìn)一步研究其抗腫瘤活性及其開發(fā)研究打下基礎(chǔ). 目的：構(gòu)建以小鼠血管內(nèi)皮生長因子受體2(VEGFR-2)為抗原肽的MHC.I類分子-抗原肽單鏈三聚體(SCT)真核表達(dá)質(zhì)粒peDNA

6、3.1(+)/VEGFR-2-β2m-H-2D<'b>. 方法：SCT的構(gòu)建 (1)由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成編碼Linker-1,Linker-2以及帶有p2m信號肽的KDR2抗原肽的DNA片段. (2)以RT-PCR法,從C57BL/6小鼠脾組織克隆H2-D<'b>及p2m的eDNA. (3)將將帶有fhm信號肽的KDR2抗原肽、p2m及H-2D<'b> DNA片段分別用Linker-1,

7、Linker-2相連,并插入peDNA3.1(+)的多克隆位點(diǎn)中,構(gòu)建成peDNA3.I(+)/VEGFR-2-β2m-H-2D<'b>真核表達(dá)質(zhì)粒. 結(jié)果：將所構(gòu)建的pcDNA3.1/132m和peDNA3/1/β2m信號肽-抗原肽-Linker-1-β2m基因重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定和測序分析,結(jié)果與預(yù)期一致.將pcDNA3.1/Linker-2重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定,結(jié)果與預(yù)期一致,表明peDNA3.1/Linker-2質(zhì)粒構(gòu)建