HLA-A2-肽四聚體的制作及其在人工抗原提呈系統(tǒng)中的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、MHCI類/肽四聚體技術(shù)的報(bào)道開創(chuàng)了抗原特異性 T 細(xì)胞檢測(cè)和分析的新紀(jì)元。十年來其應(yīng)用范圍已擴(kuò)展至幾乎所有涉及細(xì)胞免疫的基礎(chǔ)和臨床性研究領(lǐng)域。但制作程序繁雜、成本昂貴、生產(chǎn)得率很低的問題也一直阻礙著它的應(yīng)用。在諸多的技術(shù)改進(jìn)中，將抗原肽與β2m融合而制作由兩個(gè)亞單位(2C)組成的HLAI類/肽復(fù)合體及其熒光四聚體的策略被報(bào)道。盡管其制作成本明顯下降，但多年來應(yīng)用很少。原因之一是缺乏系統(tǒng)比較2C型和傳統(tǒng)3C型HLAI類/肽復(fù)合體的結(jié)構(gòu)和

2、功能性特征的信息。在諸多的應(yīng)用性研究中，可溶性MHCl類/肽復(fù)合體及其多聚體被用來制作磁珠式和膠乳微球式人工抗原提呈細(xì)胞(aAPCs)。盡管這兩種aAPCs在體外擴(kuò)增抗原特異性T細(xì)胞的能力已被充分證實(shí)，但是其在體內(nèi)誘導(dǎo)抗原特異性T細(xì)胞反應(yīng)的潛能卻少有報(bào)道。鑒于在體外擴(kuò)增的特異性CTLs進(jìn)入體內(nèi)后經(jīng)常達(dá)不到預(yù)期的過繼治療效果，因此進(jìn)一步研究aAPCs在體內(nèi)主動(dòng)免疫治療中的潛力很有必要。 本研究在三方面開展了工作：建立了可溶性HLA

3、I類/肽復(fù)合體及其熒光四聚體的制作技術(shù)：利用抗原肽-β2m融合策略制備了2C型HLA-A2/MARTl<,27-35>復(fù)合體及其四聚體，系統(tǒng)地比較了其與傳統(tǒng)3C復(fù)合體的結(jié)構(gòu)和功能性特征：利用2C和3C型HLA-A2/肽四聚體制作了膠乳微球式aAPCs，在naive小鼠體內(nèi)有效誘導(dǎo)了腫瘤抗原特異性的CTL反應(yīng)。結(jié)果如下： (1)2C、3C型HLA-A2/MARTl<,27-35>復(fù)合體和3C型HLA-A2/HER2/neu<,36

4、9-377>復(fù)合體制備：三種重組質(zhì)粒pET28a-HLA-A<'*>0201(α1-α3)．BSP、pET28a-MARTl<,27-35>-Linker-hβ2m和pET28a-hβ2m被成功構(gòu)建、表達(dá)、純化和鑒定。HLA-A2重鏈和輕鏈融合蛋白以及人工合成的．MARTl<,27-35>和HER2/neu<,369-377>抗原肽在體外被組裝折疊、生物素化，然后在FPLC系統(tǒng)中經(jīng)Superdex 75凝膠層析柱過濾純化。FPLC洗脫圖

5、顯示有四個(gè)洗脫峰。SDS-PAGE和Western blot分析證實(shí)第一洗脫峰是HLA-A2/肽單體復(fù)合物的蛋白峰；HLA-A2重鏈羧基端的His6生物標(biāo)簽未明顯影響前者的生物素化效率和四聚體的制備；另外，質(zhì)譜分析顯示起始密碼子編碼在MARTl<,27-35>肽N端的甲硫氨酸可能在原核表達(dá)中已被切除。 (2)2C和3C型HLA-A2/MARTl<,27-35>復(fù)合體的生化及結(jié)構(gòu)性特征比較：FPLC洗脫圖及其SDS-PAGE和We

6、stern blot分析證實(shí)：2C型HLA-A2/MARTl<,27-35>單體的分子大小、層析規(guī)律等與3C型單體基本一致。但相同條件下前者的折疊效率是后者的2.5倍；ELISA和DDIA實(shí)驗(yàn)顯示，盡管2C和3C型HLA-A2/MARTl <,27-35>單體均能與單抗W6/32(HLA I類分子構(gòu)象特異性)和CRll-351(HLA．A2分子構(gòu)象特異性)以及可溶性受體scFv8.3(HLA.A2/MARTl<,27-35>復(fù)合體構(gòu)象特

7、異性) 呈強(qiáng)烈的特異性的結(jié)合反應(yīng)，但是前者與W6/32和CR11-351的結(jié)合力顯著低于其3C型復(fù)合體(p<0.05，p<0.01)，而與scFv8.3的反應(yīng)性卻顯著高于其3C型復(fù)合體(p<0.05)；四聚體染色分析黑色素瘤浸潤淋巴細(xì)胞群TILl和TlL2顯示，2C和3C型JLA-A2/MARTl<,27-35>四聚體均能特異性地與膜受體TCR結(jié)合，但2C型四聚體在各個(gè)劑量組所檢測(cè)到的tetramer<'+>/CD8<'+>細(xì)胞頻率總是

8、比3C型四聚體所測(cè)的頻率稍高。這種差別在MARTl特異性T細(xì)胞較多的TIL2細(xì)胞群的染色中尤其明顯；穩(wěn)定性分析提示，2C和3C HLA-A2/MARTl<,27-35>四聚體至少在25<'O>C高溫條件下的解離速度是相當(dāng)?shù)摹?(3)2C和3C型HLA-A2/MARTl<'27-35>復(fù)合體激發(fā)抗原特異性CTL增殖和殺傷的功能比較：2C和3C HLA-A2/MARTl<'27-35>單體復(fù)合物分別與TILl細(xì)胞群共孵育 3 周后，

9、熒光四聚體染色分析顯示，2C與3C單體均能特異性地、有效地刺激MARTl<,27-35>表位特異性CTL增殖，且增殖頻率相當(dāng)：未刺激組的tetramer<'+>/CD8<'+>細(xì)胞頻率為0.89﹪，2C和3C單體刺激組則分別升高至3.60﹪和3.02﹪；<'51>Cr釋放實(shí)驗(yàn)顯示，2C或3C單體刺激的TILl細(xì)胞群均能對(duì)黑色素瘤細(xì)胞株501和MARTl<,27-35>多肽脈沖的T2靶細(xì)胞發(fā)揮強(qiáng)烈的特異性殺傷作用，即使在低劑量刺激組，殺傷

10、比率也明顯高于未刺激組(p<0.001)。但是，2C單體刺激的TILl細(xì)胞群在各個(gè)效/靶比例組中溶解靶細(xì)胞的能力均明顯高于被3C型單體刺激的TILl細(xì)胞群(p<0.01)。 (4)膠乳微球式aAPCs在鼠體內(nèi)誘導(dǎo)腫瘤抗原特異性CTL活化、增殖和殺細(xì)胞反應(yīng)：HLA-A2/K<'b>轉(zhuǎn)基因小鼠被膠乳微球式aAPCs免疫接種三次后，其脾細(xì)胞在體外被相應(yīng)的抗原肽刺激1-3天，而后進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)IFN-γ染色、HLA-A2/肽四聚體染色和細(xì)胞

11、膜CD69分子的流式分析以及細(xì)胞毒殺傷實(shí)驗(yàn)等。結(jié)果顯示：兩種由HLA-A2/肽四聚體和抗鼠CD28單抗共同包被的膠乳微球式aAPCs即使在naive小鼠體內(nèi)，仍然能夠有效地誘導(dǎo)腫瘤抗原特異性cTL活化和增殖至對(duì)照組小鼠的5-6倍；而且能夠有效激發(fā)鼠CTL對(duì)人腫瘤靶細(xì)胞的特異性識(shí)別和殺傷，殺傷率在不同效：靶比例處均明顯高于未接種組的鼠脾細(xì)胞。 這些結(jié)果提示：抗原肽-β2m融合的2C型HLA I類/肽復(fù)合體是傳統(tǒng)3C型復(fù)合體的可信替