HLA四聚體復(fù)合物檢測系統(tǒng)的構(gòu)建及初步鑒定.pdf

1、抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T 1ymphocytes,CTLs)的鑒定是研究CTL疫苗的基礎(chǔ).定量分析抗原特異性T細(xì)胞能為免疫應(yīng)答的發(fā)生過程提供重要的信息.傳統(tǒng)的鑒定方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力,敏感性低,近年來出現(xiàn)了一種新的檢測方法,即可溶性HLA肽四聚體方法.實(shí)驗(yàn)表明,該方法克服已有檢測手段的缺點(diǎn)和局限性,這種四價(jià)的重組分子在體外可有效標(biāo)記T細(xì)胞抗原識(shí)別受體(TCR),并適用于流式細(xì)胞儀檢測CTLs,由于該技術(shù)應(yīng)用原核表達(dá)重

2、組蛋白,其來源容易,僅需不同的抗原肽就可制備重組分子,因此近期得到了廣泛應(yīng)用.本實(shí)驗(yàn)旨在國內(nèi)率先建立可溶性HLA-A2-CEA四聚體檢測系統(tǒng),為腫瘤的細(xì)胞免疫機(jī)制研究提供一個(gè)方便、準(zhǔn)確的研究平臺(tái).研究內(nèi)容如下:一、PCR-SSP結(jié)合測序分析快速篩選HLA-A*0201亞等位基因成功建立相對(duì)簡單經(jīng)濟(jì)的檢測HLA-A*0201等位基因的方法,利用位點(diǎn)特異性引物進(jìn)行2-3次PCR擴(kuò)增,結(jié)合PCR產(chǎn)物測序即可快速篩選HLA-A*0201陽性的個(gè)

3、體,滿足我們所構(gòu)建的HLA-A2表位肽四聚復(fù)合物檢測系統(tǒng)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的需要.本研究不僅創(chuàng)建了篩選特定等位基因——HLA-A*0201的方法,同時(shí)也為快速檢測其它特定HLA等位基因提供了經(jīng)濟(jì)實(shí)用的模式,具有較高的實(shí)際應(yīng)用和參考價(jià)值.二、可溶性HLA-A2-CEA四聚體復(fù)合物的構(gòu)建在成功地?cái)U(kuò)增了HLA-A*0201兩個(gè)亞單位(重鏈、輕鏈)后,將可生物素化的序列連接到HLA-A2重鏈胞外區(qū)末端,分別構(gòu)建成可溶性重組分子,進(jìn)行原核表達(dá).再利用6x

4、Histiding tag進(jìn)行蛋白純化,在對(duì)HLA-A2分子高親和力的CEA694-702(癌胚抗原優(yōu)勢T細(xì)胞表位多肽GVLVGVALI)存在下,三者體外折疊成具有完整構(gòu)象的HLA-A2-CEA分子復(fù)合物.以BirA酶作用于復(fù)合物中的融合于HLA重鏈蛋白C端BSP中的賴氨酸殘基,生物?；搹?fù)合物.生物酰化的HLA肽復(fù)合物與藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的親和素以4:1結(jié)合,形成均一的四聚體結(jié)構(gòu).利用Streptavidin-shift assay