三羧酸循環(huán)蛋白復(fù)合物的鑒定.pdf

1、三羧酸循環(huán)是生物體普遍存在的一種產(chǎn)能方式，線(xiàn)粒體作為能量工廠(chǎng)正是依賴(lài)于三羧酸循環(huán)的效能。經(jīng)典的三羧酸循環(huán)包括8步反應(yīng)，由8種酶催化，分別是檸檬酸合酶(Citrate Synthase，CS)、順烏頭酸酶(Aconitase，ACO)、異檸檬酸脫氫酶(Isocitrate Dehydrogenase，IDH)、α-酮戊二酸脫氫酶(2-Oxoglutarate DehydrogenaseComplex，OGDC)、琥珀酰輔酶A合成酶(Suc

2、cinyl-CoA Synthetase，SCS)、琥珀酸脫氫酶(Succinate Dehydrogenase，SDH)、延胡索酸水合酶(Fumarase，F(xiàn)H)和蘋(píng)果酸脫氫酶(Malate Dehydrogenase，MDH)。早期，人們對(duì)三羧酸循環(huán)的認(rèn)識(shí)限于單一酶的作用，即每種酶僅催化一步反應(yīng)。隨著科學(xué)的發(fā)展，人們認(rèn)識(shí)到連續(xù)反應(yīng)的兩種酶或多種酶可能存在相互作用的關(guān)系。通過(guò)提高每種酶的配比，可能提高酶的效率。早期的工作通過(guò)研究三羧酸

3、循環(huán)酶與酶之間的相互作用以提高酶的活性，從而提高微生物發(fā)酵的效率，而缺乏在哺乳動(dòng)物中對(duì)三羧酸循環(huán)蛋白相互作用的研究。在本課題中，我們利用免疫共沉淀結(jié)合質(zhì)譜的方法在哺乳動(dòng)物中探索三羧酸循環(huán)蛋白復(fù)合物的構(gòu)成，首次發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物三羧酸循環(huán)的8種酶能形成蛋白復(fù)合物，以ACO2-IDH2-MDH2-CS為核心蛋白復(fù)合物，并包含一些電子傳遞鏈(NDUFS1，ATP5B)、脂肪酸氧化(ACAA2)、氨基酸代謝(GOT2)和糖酵解的酶(GAPDH)。同時(shí)

4、我們首次發(fā)現(xiàn)三羧酸循環(huán)具有組織特異性，且在擴(kuò)張型心肌病中三羧酸循環(huán)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯的變化。
　　第一章:FH與SDHA抗體制備
　　為了研究三羧酸循環(huán)的蛋白復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，我們通過(guò)體外構(gòu)建，原核克隆表達(dá)，蛋白純化等分子生物學(xué)技術(shù)，表達(dá)和純化了人源FH和琥珀酸脫氫酶黃素蛋白亞基(succinate dehydrogenase complex,subunitA,flavoprotein variant,SDHA)的抗原，并制備

5、了相應(yīng)的抗體，用于免疫共沉淀和質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)。體外構(gòu)建了pMAL-c5x/FH，pMAL-c5x/SDHA載體，經(jīng)轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DE3感受態(tài)細(xì)胞中，表達(dá)并純化了FH和SDHA抗原，通過(guò)免疫動(dòng)物（小鼠和兔）獲得抗血清，經(jīng)IgG純化獲得抗體，通過(guò)免疫共沉淀，免疫印跡，免疫熒光等實(shí)驗(yàn)以檢測(cè)抗體的功能，結(jié)果表明制備的FH和SDHA抗體具有免疫共沉淀，免疫印跡，免疫熒光等性能，且這兩種人源蛋白制備的抗體能與多個(gè)物種的相應(yīng)蛋白交叉反應(yīng)，如人，大鼠，小鼠，

6、豬。
　　第二章三羧酸循環(huán)復(fù)合物的研究
　　利用制備的FH和SDHA抗體，及ACO2，IDH2，MDH2，CS，DLST，SDHB等抗體探索三羧酸循環(huán)酶復(fù)合物的組成和八種酶的蛋白相互作用，以及電子傳遞鏈NDUFS1，ATP5B，氨基酸代謝GOT2，脂肪酸氧化ACAA2和糖分解GAPDH這些酶的蛋白相互作用。利用IP-MS技術(shù)研究三羧酸循環(huán)酶以及與它密切相關(guān)的電子傳遞鏈，脂肪酸氧化，氨基酸代謝和糖分解酶的蛋白相互作用，采用we

7、stern blot驗(yàn)證相互作用，蛋白質(zhì)凝膠過(guò)濾實(shí)驗(yàn)探索三羧酸循環(huán)蛋白復(fù)合物的大小及酶的分布，并利用生物信息學(xué)技術(shù)構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果表明三羧酸循環(huán)酶互相作用，彼此偶聯(lián)，共同形成大的分子復(fù)合物，且以ACO2-IDH2-MDH2-CS為核心蛋白復(fù)合物。蛋白質(zhì)凝膠過(guò)濾實(shí)驗(yàn)也證實(shí)這四種酶在體內(nèi)形成復(fù)合物，NDUFS1，ATP5B，ACAA2，和GAPDH的IP-MS實(shí)驗(yàn)也證實(shí)它們與三羧酸循環(huán)酶形成復(fù)合物。
　　第三章三羧酸循環(huán)復(fù)合

8、物的組織特異性以及與擴(kuò)張型心肌病的關(guān)系研究
　　三羧酸循環(huán)復(fù)合物是具有功能的蛋白復(fù)合物，表現(xiàn)在不同的組織器官具有不一樣的蛋白復(fù)合物。正常人與擴(kuò)張型心肌病患者的線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)差異顯著，三羧酸循環(huán)復(fù)合物的組成有變化，并且中間產(chǎn)物的水平也表現(xiàn)出明顯的差異。利用IP-MS技術(shù)研究FH相互作用蛋白在肝臟和心臟組織中的差異，和三羧酸循環(huán)酶在不同組織如脂肪和心臟中蛋白表達(dá)的差異，以及正常心臟和擴(kuò)張型心肌病心臟三羧酸循環(huán)酶復(fù)合物的不同，并利用代謝組學(xué)

9、技術(shù)探索三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物的變化。結(jié)果表明FH的相互作用蛋白在肝臟和心臟出現(xiàn)顯著性差異，在肝臟中多是尿素循環(huán)相關(guān)的酶，而在心臟中則多是三羧酸循環(huán)的酶。擴(kuò)張型心肌病患者心臟的三羧酸循環(huán)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)更為松散，相互之間連接不夠緊密，可能是復(fù)合物受到破壞，特別是核心復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，與此同時(shí)三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物如延胡索酸，蘋(píng)果酸的水平也明顯下降。
　　第四章維藥兩色金雞菊的主要成分馬里苷對(duì)胰島素抵抗細(xì)胞的三羧酸循環(huán)復(fù)合物的影響
　　兩色金

10、雞菊（Coreopsis tinctoria Nutt.）分布在我國(guó)湖北、廣東、陜西，新疆等地，具有降血壓，降血糖等作用。本研究探索兩色金雞菊的主要成分馬里苷對(duì)高糖誘導(dǎo)的胰島素抵抗的作用，并對(duì)三羧酸循環(huán)酶以及中間產(chǎn)物的影響。構(gòu)建了高糖誘導(dǎo)的胰島素抵抗細(xì)胞模型，給以馬里苷處理，檢測(cè)細(xì)胞的糖分解能力及三羧酸循環(huán)酶的mRNA，蛋白表達(dá)差異，以及利用代謝組學(xué)技術(shù)檢測(cè)中間產(chǎn)物的變化。通過(guò)糖吸收，糖分解等指標(biāo)表明成功構(gòu)建了高糖誘導(dǎo)的胰島素抵抗細(xì)胞模