CD1d四聚體檢測技術的初步改良.pdf

1、NKT細胞TCR識別由非胸腺依賴抗原與CDld結合而成的復合物。Α-GalCer為目前發(fā)現(xiàn)的NKT細胞結合效能最強的糖脂抗原,其可以裝載入CDld分子抗原結合溝槽,應用此糖脂和分子所建立的CDld四聚體技術是檢測NKT細胞的權威
　　 方法。
　　 肝臟是機體最大的消化與代謝器官,然而其在免疫學領域的作用日漸清晰,甚至有人已把肝臟作為獨立的免疫器官；NKT細胞在肝內單個核細胞比率達到8％-15％,為所有具備淋巴樣器官中最

2、多的器官。本試驗即利用肝臟內NKT細胞比率較高的特性,以評定不同制備條件建立的四聚體檢測效果,從而對其制備條件進行改良。不同肝臟單個核細胞制備方法可對NKT細胞比率產(chǎn)生影響,選擇一種穩(wěn)定的制備方法也是保證改良方案實施的重要基礎。
　　 Tween-20是常用的實驗室有機助溶劑,屬水包油型乳化劑,可用作增溶劑、擴散劑、穩(wěn)定劑、潤滑劑和抗靜電劑。CDld四聚體在制備過程中用含有Tween-20的PBS分散糖脂抗原是能否建立成功四聚體

3、的關鍵步驟,但其亦能對反應體系造成不利影響,因而在保證其分散效果的同時也應該控制Tween-20在整個反應體系里的量才能找到一個理想的平衡點。Α-GalCer與融合蛋白的孵育時間是CDld四聚體制備過程的限速步驟,現(xiàn)今的制作流程中二者的孵育時間皆在12小時以上,這完全限制了CDld四聚體技術的快速應用。
　　 本研究建立的CDld四聚體技術可對小鼠胸腺、脾臟、肝臟iNKT細胞進行檢測,并對CDld四聚體制作過程的PBS所含Twe

4、en-20濃度及α-GalCer與融合蛋白的孵育時間進行摸索,希求應用最少的Tween-20及最短的孵育時間達到良好穩(wěn)定的檢測效果的目的。
　　 方法：
　　 以肝臟內單個核細胞為檢測對象,利用含Tween-20不同濃度PBS所建立CD1d四聚體檢測其NKT比率,通過對比Tween-20濃度不同對CD1d四聚體檢測效率的差異,確定最合理的Tween-20濃度；以肝臟內單個核細胞為檢測對象,利用糖脂α-Ga1Cer與CD1

5、d-IgG1 Fc融合蛋白經(jīng)不同孵育時間所建立CD1d四聚體對其NKT比率進行檢測,通過對比孵育時間的不同對CD1d四聚體檢測效率的差異,確定最合理的孵育時間。
　　 結果：
　　 CD1d四聚體檢測NKT方法的建立應用保守建立方法,即用含Tween-201％的PBS稀釋α-Ga1Cer糖脂儲存液,并與CD1d-IgG1 Fc融合蛋白孵育過夜12小時所建立的四聚體檢測液對所提純肝臟單個核細胞、胸腺細胞、脾臟單個核細胞進行

6、檢測,可檢測到NKT細胞亞群,其檢測陽性比率與國外文獻相符,表明四聚體建立成功。
　　 用含不同濃度Tween-20 PBS(0.00％、0.05％、0.10％、0.25％、0.50％、1.00％、2.00％)制備的CD1d四聚體檢測肝臟單個核細胞內NKT細胞,對其檢測效率進行比較,在0.5％至2％范圍內增加時,所測得NKT細胞比率稍有下降趨勢或比率相當,統(tǒng)計學處理Tween-20濃度在0.5、1％、2％時,三者的檢出能力無統(tǒng)計

7、學差異,顯示Tween-20在0.5％時即能制備出具有完整檢出能力的CD1d四聚體。
　　 不同糖脂α-Ga1Cer與CD1d-IgG1 Fc融合蛋白裝載時間(1h、2h、4h、6h、8h、12h、24h)所制備的CD1d四聚體檢測肝臟單個核細胞內NKT細胞,對其檢測效率進行比較。數(shù)據(jù)表明,隨裝載時間在1h、2h、4h、6h、8h范圍內不斷增加,所測得NKT細胞比率不斷增加；在8h、12h、24h范圍內增加時,所測得NKT細胞比

8、率稍有下降趨勢或比率相當,統(tǒng)計學處理裝載時間在8h、12h、24h時,三者的檢出能力無統(tǒng)計學差異,顯示裝載時間8h時即能制備出具有完整檢出能力的四聚體。
　　 結論
　　 建立CD1d四聚體檢測技術,可以對肝臟、胸腺、脾臟NKT細胞進行檢測。在CD1d四聚體制備過程中,用于分散α-Ca1Cer糖脂抗原的PBS所含Tween-20的濃度可降低到0.5％。在CD1d四聚體制備過程中,α-Ca1Cer和CD1d-IgG1 Fc