桔霉素三聚體Tricitrinol B的抗腫瘤活性及機(jī)制研究.pdf

1、極端環(huán)境中的微生物為了適應(yīng)生存,逐步形成了獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和生理機(jī)能,能夠產(chǎn)生多種極端酶和其他生物活性物質(zhì),極端微生物資源是抗腫瘤藥物重要的資源寶庫(kù)。本論文首先對(duì)從火山口沉積物來(lái)源的桔青霉Penicillium citrinumHGY1-5中分離得到的一系列桔霉素衍生物進(jìn)行初步的抗腫瘤活性篩選,發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)全新的桔霉素三聚體Tricitrinol B具有較強(qiáng)的抑制體外腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。本論文較為全面地評(píng)價(jià)了Tricitrinol B的體外抗腫瘤

2、活性,并檢測(cè)了其對(duì)拓?fù)洚悩?gòu)酶的抑制作用,闡明Tricitrinol B是作為嵌入性的拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ毒劑來(lái)發(fā)揮抗腫瘤作用的。為了全面地評(píng)價(jià)Tricitrinol B的體外抗腫瘤作用,選取不同組織來(lái)源的17株細(xì)胞株進(jìn)行細(xì)胞增殖抑制活性的檢測(cè),結(jié)果顯示Tricitrinol B對(duì)各種組織來(lái)源的腫瘤細(xì)胞株和正常細(xì)胞株HMEC均表現(xiàn)出普遍的細(xì)胞毒作用,其平均IC50值約為4.77μM。同時(shí)檢測(cè)Tricitrinol B對(duì)兩株p-糖蛋白過(guò)表達(dá)的多藥耐

3、藥細(xì)胞株(KB/VCR和MCF-7/ADM)的細(xì)胞毒作用,發(fā)現(xiàn)Tricitrinol B對(duì)2株多藥耐藥細(xì)胞及相應(yīng)的親本細(xì)胞株表現(xiàn)出同等程度的生長(zhǎng)抑制作用,平均耐藥因子(RF)約為1,顯著低于阿霉素(ADR)和長(zhǎng)春新堿(VCR)的RF,表明Tricitrinol B具有良好的抗多藥耐藥作用。進(jìn)一步采用DNA Ladder方法證實(shí)凋亡是TricitrinolB誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的方式;采用AnnexinⅤ-FITC方法發(fā)現(xiàn)化合物Tricitrin

4、ol B誘導(dǎo)HL60細(xì)胞凋亡具有明顯的濃度和時(shí)間依賴(lài)性,其在12h時(shí)主要誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生早期凋亡,24h主要發(fā)生晚期凋亡;采用JC-1方法發(fā)現(xiàn)Tricitrinol B可以濃度和時(shí)間依賴(lài)性地降低細(xì)胞膜線粒體膜電位;利用Western Blot檢測(cè)Tricitrinol B對(duì)凋亡關(guān)鍵蛋白的影響,發(fā)現(xiàn)其可以激活凋亡相關(guān)蛋白caspase-8、Bid、caspase-3和PARP蛋白,引起不可逆的細(xì)胞凋亡;運(yùn)用凋亡抑制劑發(fā)現(xiàn)Tricitrinol

5、 B誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡主要依賴(lài)死亡受體通路來(lái)實(shí)現(xiàn)。在此基礎(chǔ)上,本論文對(duì)Tricitrinol B的抗腫瘤機(jī)制進(jìn)行了深入研究。DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶(topoisomerase, Topo)具有重要的細(xì)胞生物學(xué)功能,已經(jīng)成為抗腫瘤藥物重要的作用靶點(diǎn)。本論文應(yīng)用多個(gè)無(wú)細(xì)胞體系和細(xì)胞體系模型對(duì)Tricitrinol B的Topo抑制作用進(jìn)行多方位和多層次的研究和確證,以闡明Tricitrinol B抑制TopoⅡ的具體機(jī)制。PBR322解螺旋實(shí)驗(yàn)顯示T

6、ricitrinol B能抑制TopoⅠ的催化活性,但DNA切割實(shí)驗(yàn)和In vivo Complex of Enzyme(ICE)實(shí)驗(yàn)均表明Tricitrinol B不能穩(wěn)定TopoⅠ-DNA可切割復(fù)合物,提示Tricitrinol B的作用機(jī)制不同于喜樹(shù)堿類(lèi)化合物,Tricitrinol B對(duì)TopoⅠ的抑制作用可能是一種非特異性的抑制作用。與此形成對(duì)比的是,PBR322解螺旋反應(yīng)和kDNA去連環(huán)實(shí)驗(yàn)均表明Tricitrinol B能

7、夠劑量依賴(lài)性地抑制TopoⅡ的活性;ICE實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明Tricitrinol B能夠穩(wěn)定TopoⅡ-DNA形成的可切割復(fù)合物TricitrinolB還能誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞DNA雙鏈斷裂并誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂分子標(biāo)志y-H2AX蛋白水平升高;利用RNA干擾技術(shù),發(fā)現(xiàn)下調(diào)TopoⅡα可以降低Tricitrinol B對(duì)細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)能力。這些結(jié)果表明Tricitrinol B是新型TopoⅡ毒劑,TopoⅡ是Tricitrinol B的作用

8、靶點(diǎn)。為了探討Tricitrinol B發(fā)揮抑制TopoⅡα的具體機(jī)制,本論文進(jìn)一步觀察Tricitrinol B對(duì)TopoⅡ的各個(gè)催化環(huán)節(jié)的影響。首先,DNA伸展實(shí)驗(yàn)和溴化乙錠取代實(shí)驗(yàn)顯示Tricitrinol B能夠嵌入DNA;其次,DNA遷移實(shí)驗(yàn)表明TricitrinolB能夠抑制TopoⅡ與DNA的非共價(jià)結(jié)合;再次,利用DNA切割/再連接實(shí)驗(yàn)證明Tricitrinol B能增強(qiáng)TopoⅡ?qū)η版満秃箧淒NA的切割,也能抑制前鏈和后

9、鏈DNA的再連接,而且Tricitrinol B對(duì)后鏈的切割/再連接作用要強(qiáng)于對(duì)前鏈的切割/再連接作用,表明Tricitrinol B對(duì)前鏈和后鏈的作用有一定程度的選擇性,這一作用與經(jīng)典TopoⅡ抑制劑mAMSA的作用相似。以上研究顯示,TricitrinolB作用如下環(huán)節(jié):嵌入DNA結(jié)構(gòu),抑制酶與DNA的非共價(jià)結(jié)合,影響酶對(duì)DNA鏈的切割/再連接。綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)桔青霉來(lái)源的化合物Tricitrinol B具有較好的體外抗腫瘤活性