OEL和Fluopsin C的抗腫瘤活性及機制研究.pdf

1、目前，惡性腫瘤已經(jīng)成為嚴(yán)重危害人類健康的因素之一。惡性腫瘤的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢，乳腺癌是最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病機制復(fù)雜，尚無有效的治療手段，它的預(yù)防與治療一直備受關(guān)注，在臨床上腫瘤耐藥時有發(fā)生，使得尋找新型抗癌藥物成為當(dāng)務(wù)之急。本文主要闡述了兩種化合物的抗腫瘤活性和初步探討了它們的抗腫瘤作用機理，一種是來源于須彌紫苑的新型桉烷內(nèi)酯類化合物1-氧-11(13)-烯-12，8α-桉烷內(nèi)酯(OEL)，另一種是最早從假單胞桿菌中發(fā)現(xiàn)的代

2、謝產(chǎn)物，目前在我們實驗室得到大量合成的抗生素銅硫甲酰素(FluopsinC)。
　　 MTT法檢測了OEL對腫瘤細(xì)胞株A172、MG-63、MCF-7、U87和KB的生長抑制作用，結(jié)果顯示OEL可以有效抑制上述腫瘤細(xì)胞的生長，而OEL對正常細(xì)胞株EVC304和HL7702的細(xì)胞毒性與腫瘤細(xì)胞相比顯著降低，表明腫瘤細(xì)胞對OEL更為敏感。我們篩選抑制增殖作用尤為顯著的乳腺癌細(xì)胞株MCF-7進行作用機理的初步探討，首先，生長抑制作用結(jié)

3、果顯示，藥物抑制趨勢呈明顯的時間和劑量的依賴性增長，然后用倒置顯微鏡觀察加藥細(xì)胞的形態(tài)變化，DAPI染色后熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核的形態(tài)，AnnexinV/PI雙染法利用流式細(xì)胞儀檢測凋亡壞死率，發(fā)現(xiàn)與對照組相比加入了OEL后的細(xì)胞皺縮、產(chǎn)生凋亡小體、凋亡率增加，這些結(jié)果暗示我們，OEL可以通過細(xì)胞凋亡的方式誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞MCF-7死亡。在OEL誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，我們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)的活性氧ROS、線粒體、多種蛋白酶及激酶參

4、與了細(xì)胞的調(diào)控。OEL作用于MCF-7細(xì)胞后，ROS的產(chǎn)生顯著增加，Bcl-2/Bax的蛋白表達率明顯降低，致使線粒體膜的通透性增高、膜電勢顯著降低，促進了凋亡誘導(dǎo)因子細(xì)胞色素C釋放，進而激活了caspase-9，caspase-9的激發(fā)引發(fā)了caspase的級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。
　　 FluopsinC對腫瘤細(xì)胞株A172、K562、Hela、MCF-7和MD-MBA-231的抑制增值作用通過MTT法檢測，結(jié)果顯示Fl

5、uopsinC對實驗細(xì)胞具有非常好的細(xì)胞毒活性。同OEL一樣，F(xiàn)luopsinC以時間和濃度依賴的方式顯著抑制腫瘤細(xì)胞增殖。FluopsinC對正常細(xì)胞株EVC304和HL7702的細(xì)胞毒性與腫瘤細(xì)胞相比明顯降低，表明FluopsinC對不同細(xì)胞的毒性具有選擇性，對腫瘤細(xì)胞的作用更為敏感。早期我們選取了MCF-7和MD-MBA-231進行作用機理的初步研究。FluopsinC作用于乳腺癌細(xì)胞MCF-7和MD-MBA-231后，用顯微鏡觀

6、察細(xì)胞的形態(tài)變化，伴隨著藥物的刺激，細(xì)胞出現(xiàn)腫脹變圓、細(xì)胞膜起泡，核形態(tài)區(qū)別于凋亡呈現(xiàn)彌散狀態(tài)。PI染色后熒光顯微鏡觀察以及流式細(xì)胞儀的分析結(jié)果可以看出，加藥后的乳腺癌細(xì)胞壞死率增加，證實了FluopsinC誘導(dǎo)MCF-7和MD-MBA-231細(xì)胞死亡可以通過脹亡方式。選取MCF-7細(xì)胞進行脹亡機制的研究，2μMFluopsinC處理MCF-7細(xì)胞1h左右細(xì)胞膜開始起泡，細(xì)胞膜的通透性增加，細(xì)胞內(nèi)乳酸脫氫酶LDH和其他核酸類內(nèi)容物開始釋

7、放，伴隨著藥物的持續(xù)刺激，內(nèi)容物釋放量持續(xù)增加，9h時達到峰值;與此同時，細(xì)胞內(nèi)ATP水平與對照組相比顯著降低，8h左右降低到正常水平的30％，ROS的產(chǎn)生增加，線粒體的膜電勢顯著降低，免疫熒光染色技術(shù)和WesternBlot分析了細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白β-actin和α-tublin的變化，結(jié)果顯示這兩種蛋白被降解，細(xì)胞骨架受到破壞。
　　 本論文首次研究了新型桉烷內(nèi)酯化合物OEL的抗腫瘤活性和誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細(xì)胞死亡的作用機理