香菇多糖抗腫瘤作用的機制及抗氧化活性的研究.pdf

1、研究表明香菇多糖(Lentinan,LTN)具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫力、降血糖、抗病毒及抗氧化等生物活性,尤其是抗腫瘤活性已成為當前研究熱點。但目前關(guān)于香菇多糖抗腫瘤作用的機制尚未定論,多數(shù)學者認為多糖主要是通過增強機體的免疫功能而產(chǎn)生抗腫瘤作用。在前期研究中,本實驗室已成功分離純化了均一分子量的香菇多糖,體外實驗發(fā)現(xiàn)其對多種腫瘤細胞的增殖均有一定的抑制作用,提示香菇多糖的抗腫瘤作用除了增強免疫活性外,還可能直接抑制腫瘤細胞的增殖,誘導腫瘤

2、細胞的凋亡。此外,許多研究已經(jīng)證實香菇多糖能夠增強機體的抗氧化能力。但這些研究主要集中于分子量分布較廣的香菇粗多糖,且多為體外抗氧化實驗,而有關(guān)不同分子量段的香菇多糖體內(nèi)抗氧化活性研究還少有報道。因此本論文第一部分研究香菇多糖誘導腫瘤細胞凋亡的作用,并進一步通過研究其對腫瘤細胞骨架的影響,探討香菇多糖誘導細胞凋亡的機制;第二部分研究不同分子量香菇多糖體內(nèi)抗氧化活性,探討香菇多糖分子量與其抗氧化活性的關(guān)系。
　　第一部分香菇多糖抗腫

3、瘤作用的機制研究
　　在香菇多糖誘導鼠肝癌細胞H22凋亡的體外實驗中,通過DAPI染色法觀察細胞核形態(tài)學變化,AnnexinV-FITC/PI雙染色法檢測細胞凋亡率,PI單染色法檢測細胞周期變化,JC-1染色法檢測細胞內(nèi)線粒體膜電位,DCFH-DA染色法檢測細胞內(nèi)活性氧水平,Fluo-3/AM染色法檢測細胞內(nèi)鈣離子濃度;在香菇多糖誘導鼠肝癌細胞H22凋亡的體內(nèi)實驗中,皮下注射小鼠肝癌細胞H22建立荷瘤小鼠模型,隨機分為香菇多糖組(

4、瘤內(nèi)注射香菇多糖,200 mg/kg,qd×8)與陰性對照組(瘤內(nèi)注射等體積生理鹽水,qd×8),給藥結(jié)束后,取腫瘤組織做病理切片, H-E染色觀察凋亡細胞形態(tài)學特征,TUNEL染色檢測腫瘤組織細胞凋亡率;通過免疫熒光法觀察香菇多糖對人肝癌細胞HepG2細胞骨架形態(tài)學的影響。
　　香菇多糖作用于 H22細胞后,在熒光顯微鏡下可發(fā)現(xiàn)凋亡細胞的核染色質(zhì)濃集,著色較重,并伴有細胞核固縮,核小體碎片增加。在激光共聚焦顯微鏡下可觀察到凋亡細

5、胞通過發(fā)芽、起泡等方式形成凋亡小體。在流式細胞儀雙變量散點圖上可定量分析早期和晚期細胞凋亡率,結(jié)果表明兩者均具有明顯的劑量依賴性,高劑量組(500μg/mL)凋亡率可達15.19％。在流式細胞儀DNA直方圖上可發(fā)現(xiàn)香菇多糖使細胞阻滯于G2/M期,同時在G1峰前出現(xiàn)了代表細胞凋亡的亞“G1”峰,且該峰隨著藥物濃度的增加而增大。熒光顯微鏡的定性觀察和流式細胞儀的定量檢測結(jié)果表明,香菇多糖可劑量依賴性地降低細胞內(nèi)線粒體膜電位,同時能升高活性氧

6、水平和鈣離子濃度。H-E染色結(jié)果顯示,給予香菇多糖后腫瘤組織中可見散在分布的凋亡細胞,表現(xiàn)為核染色質(zhì)致密濃縮,核碎裂等。TUNEL染色結(jié)果顯示,給予香菇多糖后腫瘤組織中出現(xiàn)大量的凋亡細胞,表現(xiàn)為細胞核被染成棕褐色,給藥組(200 mg/kg)的凋亡細胞指數(shù)為(22.2±4.8)％,與陰性對照組(3.4±2.4)％相比,差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。香菇多糖作用于HepG2細胞12 h和24 h后,均能特異性抑制微管蛋白的聚合。細胞

7、免疫熒光結(jié)果顯示,大部分細胞內(nèi)微管解聚,僅在細胞核周圍殘留少量點狀熒光,而對微絲的作用較小,細胞內(nèi)微絲仍為粗大的較長的束狀纖維,應(yīng)力纖維清晰可見。而作用36 h后,微管不再成束,基本都被解聚,微絲縮短形成較短的束狀纖維或顆粒狀小體,偶見少數(shù)細胞有細小突起,細胞內(nèi)應(yīng)力纖維消失,細胞骨架紊亂、瓦解,細胞萎縮、變圓。
　　香菇多糖通過抑制微管蛋白的聚合,使姐妹染色單體不能一分為二,將細胞阻滯于G2/M期,腫瘤細胞分裂受阻,進而啟動細胞內(nèi)

8、凋亡程序,出現(xiàn)一系列凋亡細胞特有的形態(tài)學特征和生化特征,從而發(fā)揮抗腫瘤作用。
　　第二部分不同分子量香菇多糖體內(nèi)抗氧化活性的比較研究
　　KM小鼠隨機分為正常對照組,衰老模型組,維生素E組,香菇多糖LT1、LT2、LT3均分別設(shè)低、中、高劑量組,每組10只。除正常對照組外,其余11組每天皮下注射D-半乳糖100 mg/kg造模,造模的同時灌胃給藥干預。給藥劑量分別為維生素 E組200 mg/kg,三種香菇多糖低、中、高劑量組

9、均分別為50 mg/kg,100 mg/kg,200 mg/kg。正常對照組和衰老模型組給予等體積的生理鹽水。每天給藥1次,連續(xù)給藥60 d,每5天稱體重1次以調(diào)整給藥劑量。末次給藥后,所有動物均禁食不禁水24 h,然后眼眶取血于抗凝管中測定紅細胞膜流動性(MFU)。取心、肝、腦,用預冷的生理鹽水制成10％勻漿,4℃下3000 r/min離心10 min,取上清測定超氧化物岐化酶(SOD),谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活力以及丙二

10、醛(MDA)含量。
　　三種香菇多糖LT1(Mw=25.5 KDa),LT2(Mw=306.2 KDa)和LT3(Mw=605.4 KDa)均有不同程度的抗氧化作用,其中LT2能顯著提高衰老小鼠紅細胞膜流動性(2.458±0.023 vs.對照組2.167±0.024, p<0.05)和肝臟中SOD(147.19±4.90 vs.對照組82.26±5.55 units/mg protein, p<0.05), GSH-Px(310

11、.91±6.24 vs.對照組243.64±6.77 units/mg protein, p<0.05)的活力,同時顯著降低MDA的含量(15.91±0.31 vs.對照組23.79±1.18 nmol/mg protein, p<0.05),其抗氧化作用明顯優(yōu)于LT1和LT3(p<0.05)。
　　不同分子量的香菇多糖在體內(nèi)具有不同程度的抗氧化作用,其抗氧化活性與分子量大小有一定的關(guān)系,其中LT2(Mw=306.2 KDa)的體