姜黃素衍生物C212抗腫瘤活性及其作用機(jī)制的研究.pdf

1、目的：研究姜黃素衍生物C212的抗腫瘤活性及其作用機(jī)制
　　方法：⑴應(yīng)用MTT法檢測(cè)C212及Cur對(duì)SW620、HT-29、HCT-116、MCF-7、K562、HL-60、HerpG-2和SGC-7901等腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用。⑵觀察C212對(duì)SW620細(xì)胞集落形成的影響。⑶通過(guò)FITC/PI雙染法檢測(cè)C212對(duì)白血病細(xì)胞株K562和HL-60的凋亡作用；PI染色法檢測(cè)C212對(duì)白血病細(xì)胞K562和HL-60細(xì)胞周期的影響；

2、JC-1染色檢測(cè)C212作用于白血病細(xì)胞后，對(duì)線粒體膜電位的影響。⑷利用Western Blot法檢測(cè)C212對(duì)細(xì)胞周期相關(guān)調(diào)控蛋白、細(xì)胞凋亡通路中相關(guān)因子和相關(guān)抑癌因子表達(dá)量的影響。⑸熒光淬滅法檢測(cè)C212與Hsp90蛋白不同片段的相互作用。⑹采用Western Blot法檢測(cè)C212對(duì)Hsp90客戶(hù)蛋白表達(dá)量的影響。⑺通過(guò)免疫共沉淀法檢測(cè)C212作用后的HL-60細(xì)胞株中Hsp90客戶(hù)蛋白的表達(dá)。⑻通過(guò)應(yīng)用蛋白酶體抑制劑MG132來(lái)

3、探討C212促進(jìn)Hsp90客戶(hù)蛋白p-Akt降解的途徑。
　　結(jié)果：①經(jīng)過(guò)C212處理腫瘤細(xì)胞48h后，其表現(xiàn)出對(duì)SW620、HT-29、HCT-116、MCF-7、K562、HL-60、HerpG-2和SGC-7901等具有顯著的增殖抑制作用，優(yōu)于其母體結(jié)構(gòu)姜黃素，并呈濃度依賴(lài)性，MTT法測(cè)得 IC50值都＜10μM；C212對(duì)白血病細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng)也呈時(shí)間依賴(lài)性。②SW620經(jīng)C212作用后，隨著藥物濃度的增加，相同時(shí)間內(nèi)所形

4、成的集落數(shù)也逐漸減少，集落體積也較對(duì)照組小。③1.5、3、4.5μmol/L C212和0.8、1.6、2.4μmol/L C212分別作用于K562和HL-60細(xì)胞48h后，隨著藥物濃度的增加，其凋亡率的趨勢(shì)也增加，與陰性對(duì)照組相比，凋亡率分別可以達(dá)到59.80±1.14％和40.50±0.94%(P<0.01)。細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)顯示C212作用于K562和HL-60細(xì)胞24h后，加藥處理組與陰性對(duì)照組相比，G2/M期K562和HL-60

5、細(xì)胞比例明顯增加。與陰性對(duì)照組相比，加藥組的JC-1 Red的強(qiáng)度減弱，JC-1 Green的強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，說(shuō)明C212能夠耗散白血病細(xì)胞的線粒體膜電位，并且在短時(shí)間內(nèi)60min也能引起這種效應(yīng)。④Weston-Blotting實(shí)驗(yàn)顯示C212通過(guò)線粒體caspase-9/caspase-3途徑誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡，它能夠下調(diào) K562和 HL-60細(xì)胞里與 G2/M期相關(guān)的周期調(diào)控蛋白cyclinB1、Cdc2和p-Cdc2和的表達(dá)水平

6、。另外，C212能夠增加K562細(xì)胞中抑癌因子p53、p21和p27的表達(dá)。⑤C212能夠與Hsp90蛋白不同片段發(fā)生結(jié)合，其中與C端片段結(jié)合能力最強(qiáng)。⑥C212可以下調(diào)K562及HL-60細(xì)胞中Hsp90的相關(guān)客戶(hù)蛋白p-Akt、p-Raf、p-Mek和p-Erk等的表達(dá)水平。⑦用Hsp90抗體對(duì)C212作用的HL-60細(xì)胞裂解液進(jìn)行免疫共沉淀，與陰性對(duì)照組相比，C212可引起與Hsp90結(jié)合的客戶(hù)蛋白p-Akt含量下降。⑧從免疫印跡

7、的結(jié)果分析，由C212引起的Hsp90客戶(hù)蛋白p-Akt的降解完全被蛋白酶體抑制劑MG132阻斷。
　　結(jié)論：⑴C212呈濃度依賴(lài)性地抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，其增殖抑制作用優(yōu)于母體結(jié)構(gòu)姜黃素，并且C212能夠影響SW620細(xì)胞集落的形成。⑵C212能夠引起白血病細(xì)胞周期G2/M期阻滯，促進(jìn)線粒體膜電位的耗散來(lái)觸發(fā)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)發(fā)生，從而引起細(xì)胞凋亡。⑶C212能夠影響細(xì)胞周期調(diào)控蛋白、凋亡通路相關(guān)蛋白和相關(guān)抑癌因子的表達(dá)。