流體力學(xué)注射IL-36Ra質(zhì)粒對ConA誘導(dǎo)小鼠肝損傷的保護作用.pdf

1、目的：
　　白細胞介素(interleukin，IL)-36亞家族包括五位成員：IL-36a、IL-36b、IL-36γ、IL-36受體拮抗劑(IL-36 receptor antagonist，IL-36Ra)和IL-38。IL-36Ra之前又被稱作IL-1家族5(IL-1 family5，IL-1F5)、FIL-1δ和IL-1δ。IL-36Ra與IL-1受體相關(guān)蛋白2(IL-1 rece ptor-related protei

2、n2，IL-1Rrp2)結(jié)合后因不具有IL-36a、IL-36b及IL-36γ所具有的B4/5和b11/12循環(huán)結(jié)構(gòu)，從而阻礙IL-1受體輔助蛋白(IL-1 receptor accessory protein，IL-1R AcP)的募集和功能性信號復(fù)合體的形成，最終可抑制轉(zhuǎn)錄因子(nuclear factor，NF)-?B和絲裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)通路發(fā)揮其生

3、物學(xué)功能。近年來，肝臟疾病的全球內(nèi)發(fā)病率一直居于首位，其中肝炎尤為突出，病毒感染是引起肝炎的主要原因，病毒性肝炎的主要發(fā)病機制是病毒抗原進入人體后引起的人一系列的免疫反應(yīng)從而造成肝損傷。刀豆蛋白A(concanavalinA，ConA)誘導(dǎo)的急性小鼠肝損傷能夠很好地模擬病毒性肝炎與自身免疫性肝炎。因此，本研究擬克隆人IL-36Ra基因，構(gòu)建其真核、原核表達載體，構(gòu)建ConA誘導(dǎo)小鼠肝損傷模型，利用ConA誘導(dǎo)的肝損傷模型，從分子水平和動

4、物水平研究IL-36Ra的過表達在免疫性肝炎中的作用，并初步探討其作用機制，為臨床肝病的治療提供理論和實驗依據(jù)。
　　方法：
　　1.從人皮膚中提取總RNA，設(shè)計引物通過RT-PCR方法擴增IL-36Ra基因的全長編碼序列，將其克隆入真核表達載體pcDNA3.1/V5-His中，構(gòu)建其重組質(zhì)粒pcDNA-3.1-hIL-36Ra-V5-His；以pcDNA-3.1-hIL-36Ra-V5-His為模板擴增IL-36Ra成熟蛋

5、白編碼區(qū)，構(gòu)建IL-36Ra原核表達載體pET-44-hIL-36Ra。
　　2.構(gòu)建ConA誘導(dǎo)的肝損傷動物模型：將BALB/c小鼠分為4組，每組12只，正常對照組注射等量生理鹽水，其余3組小鼠分別注射ConA制備肝損傷模型(ConA誘導(dǎo)劑量為15 mg/kg)。將構(gòu)建的質(zhì)粒pcDNA3.1-hIL-36Ra-V5-His以尾靜脈注射方式提前1 d注射到小鼠體內(nèi)，在造模第8小時和第24小時分別處死部分小鼠，收集樣本。小鼠肝組織病

6、理學(xué)變化通過蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining，HE)方法檢測，小鼠血清中轉(zhuǎn)氨酶水平的檢測采用丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Alanine aminotransferase，ALT)和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Aspartate aminotransferase，AST)法，相關(guān)細胞因子和趨化因子含量的測定則通過逆轉(zhuǎn)錄PCR和細胞因子的酶聯(lián)免疫吸附法測定(enzyme-linked immuno sorbent as

7、say，ELISA)。
　　結(jié)果：
　　1.將擴增出人IL-36Ra的基因序列插入到pcDNA3.1/V5-His中，成功構(gòu)建了IL-36Ra原核、真核表達載體，測序結(jié)果均與GenBank中的基因序列一致。
　　2.造模8 h、24 h分批處死小鼠，心臟采血后，實驗組小鼠血清中腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF)-a、干擾素(interferon，IFN)-a、IL-17、AST和ALT水

8、平在注射ConA后8 h較ConA模型組和陰性對照組均有降低(P<0.01)，小鼠肝組織切片經(jīng)HE染色，光學(xué)顯微鏡下可觀察到注射IL-36Ra重組質(zhì)粒的小鼠肝臟損傷均較模型組和陰性對照組有不同程度的減輕，趨近空白對照組結(jié)果。
　　結(jié)論：
　　成功構(gòu)建了IL-36Ra原核和真核表達載體。并將其真核載體pcDNA-3.1-hIL-36Ra-V5-His采用無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒提取后采用高壓流體力學(xué)注射方式注射到肝損傷模型小鼠體