DNA脫甲基化對(duì)整合至rDNA區(qū)外源基因hFⅧ表達(dá)量的影響.pdf

1、DNA甲基化作為一種基因表達(dá)調(diào)節(jié)機(jī)制，在許多生物學(xué)過(guò)程中扮演著重要的角色，包括胚胎發(fā)育、遺傳印記、細(xì)胞分化和腫瘤發(fā)生等。pHrneo是被我室構(gòu)建的一種人類核糖體DNA打靶載體。它能靶向外源基因到人類核糖體DNA區(qū)。由pHrneo攜帶的外源基因能穩(wěn)定地在多種細(xì)胞中表達(dá)，包括HL7702(人類肝細(xì)胞)和HT1080(人類纖維肉瘤細(xì)胞)，但是，其表達(dá)效率有待于進(jìn)一步提高。影響定點(diǎn)整合目的基因表達(dá)的因素可能有多種，包括目的基因的拷貝數(shù)、DNA甲

2、基化修飾、組蛋白的乙?；揎椀?。這里我們從DNA甲基化修飾的角度，探究其對(duì)定點(diǎn)整合目的基因表達(dá)的影響。 目的：通過(guò)比較脫甲基化藥物5-aza-2’-deoxycytidine處理組和對(duì)照組定點(diǎn)整合克隆細(xì)胞株目的基因人凝血因子Ⅷ的表達(dá)情況，以及目的基因CMV啟動(dòng)子區(qū)甲基化情況，研究DNA甲基化對(duì)目的基因表達(dá)的影響。 方法：我們選擇三種不同濃度的脫甲基化藥物5-aza-2’-deoxycitidine-5μM、10μM、20

3、μM，分別對(duì)pHrneoSK39-25細(xì)胞株處理72小時(shí)和120小時(shí)，同時(shí)以未加脫甲基化藥物處理的定點(diǎn)整合克隆細(xì)胞株、脫甲基化藥物處理的HT1080細(xì)胞株和相同條件下未處理細(xì)胞的同濃度的脫甲基化藥物為對(duì)照組。收集各組細(xì)胞上清，通過(guò)ELISA檢測(cè)各組hFⅧ的表達(dá)情況。此外，用重亞硫酸鹽測(cè)序PCR，確定CMV啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài)。 結(jié)果：ELISA檢測(cè)各組目的基因表達(dá)情況顯示，用5-aza-2’deoxycytidine處理72小時(shí)