脈沖電磁場對低彈多孔鈦合金的生物協(xié)同效應研究.pdf

1、背景：
　　多孔鈦合金與實體鈦合金相比能夠改善植入物的骨整合，是近年金屬植入物研究熱點。但是多孔鈦合金（Ti-6Al-4V）孔隙結(jié)構(gòu)內(nèi)部骨長入不是十分理想，特別是體積較大多孔材料中心骨長入較少。經(jīng)過前期的研究，我們分析骨長入不佳的可能原因為：1、多孔結(jié)構(gòu)的采用僅能降低鈦合金部件表觀彈性模量，而材料本身力學性能沒有實質(zhì)變化，與骨組織微觀力學性能不匹配依然存在；2、正常骨組織具有壓電效應，其力-電轉(zhuǎn)換特性可將外界應力刺激轉(zhuǎn)換為內(nèi)部電磁

2、信號，電信號對于骨修復與改建至關重要，而植入部位由于正常骨組織的缺失，無法產(chǎn)生骨修復所需的相應電磁信號。
　　為解決上述問題，本研究采用電子束熔融（Electron beam melting，EBM）技術(shù)，以新型低彈性模量 Ti-24Nb-4Zr-7.9Sn（Ti2448）合金粉末制備新型低彈性模量多孔鈦合金；同時，引入外源性脈沖電磁場（Pulsed Electromagnetic Fields，PEMF）進行干預，模擬正常骨組織

3、產(chǎn)生的內(nèi)源性電磁信號。課題組前期研究已證實了PEMF可加強成骨細胞與鈦合金（Ti-6Al-4V）表面的生物兼容性。然而，PEMF和新型低彈性模量多孔鈦合金協(xié)同的生物學效應尚未見報道。因此，本研究通過體外細胞實驗和動物體內(nèi)埋植實驗，驗證PEMF與低彈性模量多孔鈦合金的協(xié)同生物學作用。
　　目的：
　　1、評價PEMF對多孔Ti2448材料表面成骨細胞活性的影響；
　　2、評價PEMF對動物體內(nèi)多孔Ti2448植入物的骨長

4、入和骨整合的作用效果。方法
　　1、多孔 Ti2448材料的制備：沿用課題組前期研究的多孔參數(shù)，在Materialise軟件中設計多孔鈦合金三維模型，將模型數(shù)據(jù)導入 EBM設備，以新型低彈鈦合金Ti2448粉末為原料制備兩種外部規(guī)格的多孔Ti2448材料，采用掃描電子顯微鏡檢測材料表面形態(tài)和元素組成；
　　2、PEMF平臺的搭建：PEMF平臺由PEMF發(fā)生器和線圈組成。PEMF發(fā)生器使用GHY-Ⅲ型；線圈則分為兩種，細胞實驗

5、用線圈為HelmHolz雙線圈，動物實驗用線圈為改進型HelmHolz三線圈以獲得更大范圍的均勻電磁場。將線圈與電磁場發(fā)生器連接并通電，待電流穩(wěn)定后使用高斯計檢測線圈內(nèi)部和中心區(qū)域的磁感強度，以及周圍環(huán)境的磁感強度。
　　3、體外細胞實驗：小鼠成骨前體細胞 MC3T3-E1接種于多孔 Ti2448片表面，每日進行PEMF暴露2h，與未暴露PEMF的多孔Ti2448片表面細胞進行比較，在暴露后1天、4天、7天等不同時間點通過細胞增殖

6、、掃描電子顯微鏡、活死細胞熒光染色、實時定量PCR等細胞學檢測手段進行分析。
　　4、動物體內(nèi)試驗：24只雌性成年新西蘭兔隨機分為2組，雙側(cè)股骨外側(cè)髁部植入多孔Ti2448棒，一組進行PEMF暴露2h/日，一組無PEMF暴露，術(shù)后4周、12周取材行熒光觀察、Van Gieson染色檢測等。
　　結(jié)果：
　　制備的多孔Ti2448材料為規(guī)則疏松多孔結(jié)構(gòu)，孔徑710±42μm，孔隙率68±5.3％，多孔鈦片直徑12 mm×

7、高度3 mm，多孔鈦棒直徑6 mm×高度10 mm，表面形態(tài)粗糙。
　　成功搭建用于細胞實驗和動物實驗的脈沖電磁場發(fā)生平臺，經(jīng)檢測，線圈內(nèi)部磁感強度為2 mT，周圍環(huán)境磁感強度為0.05±0.002 mT。
　　細胞增殖實驗中脈沖電磁場刺激后第1天沒有明顯差別，第4天、第7天實驗組（PEMF）細胞數(shù)均高于對照組（p<0.01）；活死細胞熒光染色發(fā)現(xiàn)兩組多孔Ti2448片表面大多數(shù)為活細胞綠色熒光，死細胞紅色熒光相對較少，而實

8、驗組與對照組相比可見更多的綠色熒光細胞與細胞群的形成，高倍鏡下細胞偽足清晰，細胞狀態(tài)良好；掃描電鏡下也可見明顯細胞偽足，細胞狀態(tài)良好，低倍鏡下實驗組細胞數(shù)量也明顯多于對照組；成骨相關基因PCR結(jié)果顯示，第4天對照組與實驗組的堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）和骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（bone morphogenetic protein，BMP-2）基因表達沒有差異，而實驗組的1型膠原（type1 collagen

9、，Col-1）、骨鈣素（osteocalcin，OCN）、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）和runt相關轉(zhuǎn)錄因子2（runt-related transcription factor2，Runx2）基因表達量均高于對照組（p<0.05），第7天實驗組ALP、Col-1、OCN、Runx2和BMP-2基因表達量均高于對照組（p<0.05），而OPN的表達量沒有差異，但已處于較高表達水平。
　　動物實驗中新骨（鈣鹽沉積）熒光

10、標記成線性排列，術(shù)后4周和12周，實驗組新生骨沉積速率（兩種熒光間距）均高于對照組（p<0.05），Van Gieson染色發(fā)現(xiàn)，術(shù)后4周兩組的多孔Ti2448植入材料周圍均有散在新生骨組織環(huán)繞，新骨與材料之間可見明顯縫隙，對照組新骨長入較少且中心部位空洞，實驗組有較多新骨長入，中心部位也可見少量不規(guī)則新骨長入；術(shù)后12周，兩組多孔材料內(nèi)部均有較多的骨長入，實驗組與對照組相比，骨長入量則更多，對照組材料與新骨之間還存在少量的間隙，而實驗

11、組新骨和材料結(jié)合緊密，骨整合良好。新骨量百分比半定量分析顯示，術(shù)后4周和12周，實驗組新生骨面積百分比均高于對照組（p<0.05）。
　　結(jié)論：
　　EBM技術(shù)制備的多孔 Ti2448植入物表觀彈性模量和微觀力學性能都能夠更好的與骨組織匹配。PEMF在體外能夠促進多孔Ti2448材料表面成骨前體細胞的活性，在體內(nèi)能夠加強多孔Ti2448植入物骨長入和骨整合，表明PEMF與多孔Ti2448協(xié)同作用效果良好，二者的聯(lián)合應用具有廣