不同材質(zhì)人工晶體納米微區(qū)表面特性及其生物粘附性的研究.pdf

1、目的：
　　治療白內(nèi)障惟一有效的措施是手術(shù)摘除混濁的晶體，植入人工晶狀體(intraocular lens,IOL)。本研究擬對市面常見聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、疏水性丙烯酸酯、親水性丙烯酸酯以及硅凝膠4種不同材質(zhì)、同一屈光度數(shù)的人工晶狀體表面性能進(jìn)行檢測，包括表面形貌，表面電荷，濕潤性以及表面蛋白、細(xì)菌、細(xì)胞粘附的情況進(jìn)行比較，綜合評價、分析IOL光學(xué)表面特性與其生物相容性存在著怎樣的關(guān)聯(lián)，在細(xì)胞和分子水平上了解術(shù)后并發(fā)癥的

2、發(fā)病機制，為進(jìn)行IOL的性能改進(jìn)及構(gòu)建更完善的人工晶狀體系統(tǒng)提供參考數(shù)據(jù)。本研究對于減少IOL術(shù)后并發(fā)癥的產(chǎn)生，減少相關(guān)醫(yī)療保險費用的龐大支出、提高白內(nèi)障的手術(shù)質(zhì)量及患者的視覺質(zhì)量具有重要的科學(xué)意義、社會意義，并且為臨床醫(yī)師選擇不同材料IOL時提供一定的參考。
　　方法：
　　1、粗糙度的測量:原子力顯微鏡(Atomic force microscopy，AFM)，空間分辨率為納米級的表征方法，是利用納米尺寸的探針在樣品表面

3、進(jìn)行逐級光柵掃描得到樣品表面的形貌。使用無創(chuàng)傷鑷子取出15枚全新的IOL樣品，固定在樣品臺上，安裝導(dǎo)電針，下針，對后表面光學(xué)區(qū)的不同區(qū)域進(jìn)行掃描分析，共振頻率245k HZ，分辨率512×512，電腦軟件Nonoscope8.0分析。
　　2、接觸角的測量:全自動接觸角測定儀，可以檢測液體對固體的浸潤性。接觸角是反應(yīng)材料親疏水性的一個重要指標(biāo)，接觸角越大，疏水性強。采用去離子水統(tǒng)一控制水滴大小，給注射器施加壓力將4微升水滴在鏡片表

4、面，在接觸的時刻連接電腦獲得圖像。
　　3、表面電荷測量:靜電力顯微鏡(Electric force microscopy，EFM)源于原子力顯微鏡(AFM)，是掃描力顯微鏡家族中探測長程作用力的儀器。測量過程中，EFM探針在每一根掃描線上進(jìn)行兩次掃描，第一次掃描為AFM-tappingmode掃描，得到樣品表面的高度像;第二次掃描時，向針尖施加設(shè)定的調(diào)制電壓，并與樣品表面保持在設(shè)定的高度，沿第一次掃描的軌跡進(jìn)行樣品的EFM掃描。

5、靜電力顯微技術(shù)可以同時獲得樣品納米尺度下的高度圖像和靜電力特征圖像。
　　4、IOL表面細(xì)胞粘附:將傳代培養(yǎng)處于細(xì)胞增殖期的人類LECs細(xì)胞系SRA01/04用胰蛋白酶-EDTA消化液消化成單個細(xì)胞懸液后調(diào)細(xì)胞數(shù)至6×106/ml，將IOL放置96孔板中，取懸液10ul接種于每組IOL表面，于37℃5％ CO2條件下培養(yǎng)1h，之后再加入200ul的培液;未放置IOL的孔中加入同體積LEC細(xì)胞作為空白對照組;24h后觀察細(xì)胞粘附情況

6、，并采用HE染色記錄細(xì)胞粘附狀況。
　　5、不同細(xì)菌在IOL表面的粘附:將表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌分別接種于LB培養(yǎng)基中;37℃培養(yǎng)過夜;低溫高速離心機4000 rpm/min，5min; PBS(PH=7.2)配置懸液1×108 cfu/ml。將4種材質(zhì)IOL各5枚置于1 ml菌液中，37℃，1.5h后取出，置于5 ml NS的塑料離心管中，在HZS-H型水浴振蕩器，以100r/min振蕩，時間為2 min，將IO

7、L表面未粘附的細(xì)菌洗掉;取出IOL，制作2枚掃描電子顯微鏡IOL標(biāo)本和3枚細(xì)菌培養(yǎng)定量測定IOL標(biāo)本。
　　6、IOL表面蛋白粘附:125I標(biāo)記ECM蛋白（纖連蛋白、玻連蛋白、四型膠原蛋白）探針稀釋于PBS緩沖液于合適的放射性活度1000ul反應(yīng)液用放射免疫檢測法，每枚IOL分別與125I標(biāo)記的纖連蛋白、玻連蛋白、四型膠原蛋白，37℃水浴孵育，然后，用BSS緩沖液反復(fù)漂洗IOL晶體上的放射性標(biāo)記蛋白的量在第一天和第七天時分別用wa

8、velength counter檢測，表示為每分鐘計數(shù)。
　　結(jié)果：
　　1、粗糙度測量:原子力顯微鏡測量結(jié)果顯示:所有IOL表面均相對平滑，但從納米級別分辨率可觀察到不同生物材料IOL的光學(xué)區(qū)仍存在特異性，表面粗糙度值存在顯著性差異。PMMA材質(zhì)的IOL較丙烯酸酯、硅凝膠IOL相對粗糙，Ra值最高，表面存在明顯凹槽及不規(guī)則的細(xì)微劃痕，這些劃痕很有可能是在車床生產(chǎn)及拋光的過程中產(chǎn)生。疏水性丙烯酸IOL表面布有不同深度和密度的

9、孔隙。相反，親水性丙烯酸酯IOL比疏水性丙烯酸IOL表面孔隙較小且較均勻。硅凝膠IOL表面均勻分布細(xì)小的孔隙、偶爾可觀察到“嵴”狀突起。PMMA IOL組，同一公司的紫外吸收型PMMA IOL粗糙度Ra值顯著高于臨床中已不常用的普通PMMA IOL(P＜0.05)。
　　2、接觸角測量:不同生物材料IOL之間接觸角存在顯著差異(P＜0.05)。疏水性丙烯酸酯以及硅凝膠IOL接觸角明顯高于親水性丙烯酸酯IOL與PMMAIOL(P＞0

10、.05)。晶體表面聚合物中非極性基團的存在減弱了材料與水之間的相互作用，從而接觸角變大，疏水性增強。硅凝膠IOL表面接觸角SCA值最大為106.54°，明顯高于其他材質(zhì)人工晶體，表現(xiàn)為較強的疏水性(P＜0.05);經(jīng)肝素表面修飾PMMA IOL比未經(jīng)表面修飾的PMMA IOL接觸角顯著降低，親水性增加（P＜0.05）。
　　3、表面電勢檢測:不同IOL樣品表面電勢差異顯著。所有的PMMA IOL均表現(xiàn)為正電性，其中普通的PMMA

11、IOL(KZ60BN)表面電勢值為4.65v±0.05v明顯高于紫外吸收型PMMA IOL（表面電勢值平均為1.3±0.01V）(P＞0.05)。通過比較同一廠家的兩枚PMMA IOL發(fā)現(xiàn)，肝素表面修飾與未修飾改性的IOL相比，表面電性無顯著變化(P＞0.05)。一般來說，疏水性丙烯酸酯IOL比PMMAIOL表面電勢高，如MA60BM IOL平均為6.2±0.1V的(P＜0.05)。Alcon和HOYA兩個廠家的藍(lán)光濾過紫外吸收型疏水性

12、丙烯酸酯IOL，改變了表面電位的性質(zhì)，表現(xiàn)出負(fù)電荷。
　　4、細(xì)胞粘附實驗:LEC接種24h內(nèi)倒置相差顯微鏡下觀察，IOL表面生長的LEC細(xì)胞具有典型的上皮細(xì)胞特征，胞體形態(tài)呈規(guī)則的六角形或橢圓形，且可見正在分裂增殖的細(xì)胞。不同材料之間的人工晶體上皮細(xì)胞系SRA01/04的黏附情況有顯著差異。疏水性丙烯酸酯IOL細(xì)胞粘附明顯多于其他材料IOL; HE染色光學(xué)顯微鏡結(jié)果，發(fā)現(xiàn)硅凝膠和親水性丙烯酸酯IOL表面細(xì)胞粘附最少，且明顯低于P

13、MMA IOL;與普通PMMA IOL相比，肝素表面修飾PMMAIOL(AAREN，HSP-55B)表面細(xì)胞粘附明顯減少（P＜0.05）。
　　5、細(xì)菌粘附實驗:疏水性丙烯酸酯和硅凝膠IOL表面S.epidermid細(xì)菌粘附相對較多，其次是PMMA IOL、親水性丙烯酸酯IOL。與普通PMMA IOL(AAREN，RS-55B)相比，肝素表面修飾PMMAIOL(AAREN，HSP-55B)表面S.epidermid細(xì)菌粘附明顯減少

14、(P＜0.05)。在疏水性丙烯酸酯IOL組中，表面負(fù)電性的藍(lán)光濾過型疏水性丙烯酸IOL(HOYA，YA-60BB)比表面帶正電荷的藍(lán)光濾過型疏水性丙烯酸IOL(ARREN，EC-3Y)細(xì)菌粘附多，差異顯著(P＜0.05)，銅綠假單胞菌細(xì)菌粘附結(jié)果與表皮葡萄球菌粘附結(jié)果一致。黃色葡萄球菌粘附結(jié)果存在異同，其中硅凝膠IOL粘附較少，其他人工晶體粘附趨勢與表皮葡萄球菌相同。
　　6、蛋白粘附實驗:不同材質(zhì)人工晶體表面細(xì)胞外基質(zhì)纖連蛋白、

15、玻連蛋白以及四型膠原蛋白的粘附差異顯著。三種蛋白的粘附趨勢基本相似，疏水性丙烯酸酯和親水性丙烯酸酯人工晶狀體表面蛋白粘附相對較多，其次是硅凝膠人工晶狀體，PMMA IOL的表面粘附蛋白最少，差異顯著(P＜0.05=。
　　結(jié)論：
　　1、不同材質(zhì)IOL表面粗糙度以及粘附性存在顯著差異，不同廠家車床生產(chǎn)及拋光的工藝差異也會造成IOL表面性質(zhì)的異同。其中PMMA IOL表面最粗糙，與臨床中觀察到其后發(fā)性白內(nèi)障的發(fā)生率最高相一致。

16、其次是丙烯酸酯和硅凝膠IOL;
　　2、肝素表面修飾以及加入黃色基團對IOL表面粗糙度沒有影響，肝素修飾后IOL接觸角下降，親水性更強;
　　3、接觸角反應(yīng)生物材料的親疏水性，硅凝膠IOL表面接觸角最大，具有很強的疏水性。硅凝膠表面細(xì)菌粘附最多，可能與疏水性越強，粘附力可能越大有關(guān)。但對于不同菌種，仍有其他影響因素，比如表面電勢影響IOL與細(xì)菌之間的相互作用;
　　4、靜電力顯微鏡為IOL表面電學(xué)特性的檢測提供了強有力

17、的工具。不同材質(zhì)IOL表面電性有正負(fù)差異，與其植入后的粘附性密切相關(guān);
　　5、晶體上皮細(xì)胞在人工晶體材料表面黏附的情況而言，親水性丙烯酸酯IOL和硅凝膠IOL最少，親水性材料粘附力小，因此后PCO發(fā)生也相應(yīng)下降。硅凝膠盡管細(xì)胞粘附少，因為其化學(xué)性質(zhì)以及表面電荷的影響，致使其ACO易發(fā)生，反而PCO發(fā)生率下降;
　　6、IOL對細(xì)胞、細(xì)菌以及基質(zhì)蛋白的粘附性不同，不能用材質(zhì)的單一表面特性解釋，可能是眾多因素共同作用的結(jié)果，應(yīng)