Dact2在胃癌中的表觀遺傳學(xué)改變及功能研究.pdf

1、胃癌是威脅人類健康的惡性腫瘤性疾病之一，目前在世界范圍內(nèi)位于癌癥相關(guān)死亡原因第二位。研究表明，Wnt信號(hào)通路的失調(diào)與消化道腫瘤的發(fā)生關(guān)系十分密切。Dact(Homo sapiens dapper，antagonist ofβ-catenin)是wnt/β-catenin信號(hào)通路的負(fù)性調(diào)節(jié)基因家族。Dact1和Dact3的表達(dá)均受到表觀遺傳學(xué)調(diào)控，分別在肝癌和結(jié)腸癌中通過調(diào)控wnt/β-catenin信號(hào)通路發(fā)揮抑癌基因的作用。但是Dac

2、t2在腫瘤中的作用文獻(xiàn)報(bào)道很少。Dact2在胃癌中的表觀遺傳學(xué)變化及與胃癌發(fā)生關(guān)系至今尚無報(bào)道，能否成為胃癌的候選抑癌基因尚不清楚。
　　 目的:本研究旨在檢測(cè)Dact2在原發(fā)性胃癌和胃癌細(xì)胞系中的甲基化情況及表達(dá)改變，并結(jié)合臨床病理資料探討Dact2對(duì)胃癌早期診斷的臨床價(jià)值；研究Dact2在胃癌細(xì)胞中的功能，分析其對(duì)Wnt信號(hào)通路的調(diào)控作用，探討胃癌發(fā)生發(fā)展的可能機(jī)制。
　　 方法:本課題選用了8株胃癌細(xì)胞系，分別是：

3、BCG823、MGC803、N87、AGS、PHM82、SGC7901、NUGC3和MNK45。應(yīng)用RT-PCR和Western blot的方法在7株胃癌細(xì)胞系中檢測(cè)甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-aza-2’-deoxycytidine(5-aza-dc)處理前后Dact2在mRNA及蛋白水平的表達(dá)變化；應(yīng)用甲基化特異性PCR檢測(cè)胃癌細(xì)胞系和原發(fā)性胃癌組織標(biāo)本DNA中Dact2甲基化情況。通過轉(zhuǎn)染Dact2真核表達(dá)載體恢復(fù)其在S胃癌細(xì)胞株SGC7

4、901中的表達(dá)，觀察Dact2對(duì)SGC7901的克隆形成、凋亡、周期、遷移的影響；應(yīng)用熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)，在胃癌細(xì)胞系SGC7901中檢測(cè)Dact2對(duì)Wnt信號(hào)通路的調(diào)控作用；應(yīng)用western blot檢測(cè)Dact2表達(dá)對(duì)其下游效應(yīng)蛋白(c-myc、MMP-2)的影響。為證實(shí)Dact2在活體中的抑癌作用，我們應(yīng)用裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)觀察Dact2對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響，計(jì)算抑瘤率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 結(jié)果:應(yīng)用甲基化特異PCR技術(shù)檢測(cè)8

5、株細(xì)胞系BCG823、MGC803、N87、AGS、PHM82、SGC7901、NUGC3和MNK45中Dact2甲基化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)PHM82和SGC7901中Dact2存在完全甲基化改變。半定量逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)檢測(cè)上述8株胃癌細(xì)胞去甲基化藥物5-aza-dc處理前后Dact2 mRNA水平變化，發(fā)現(xiàn)在PHM82和SGC7901中Dact2 mRNA不表達(dá)，經(jīng)5-aza-dc處理后恢復(fù)表達(dá)。結(jié)合MSP結(jié)果提示Dact2啟動(dòng)子區(qū)甲基化調(diào)控了

6、其mRNA表達(dá)。在95例人原發(fā)性胃癌組織中，Dact2甲基化率達(dá)55.8％(53/95例)，而在正常胃黏膜中未見甲基化改變(0/7例)。為更好的理解Dact2在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用，我們采用Dact2表達(dá)載體轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞系SGC7901使Dact2再表達(dá)的方法，觀察其潛在抑癌作用，發(fā)現(xiàn)Dact2能夠降低SGC7901的克隆形成能力及遷徙能力，使細(xì)胞停滯在G2/M期，但是其對(duì)凋亡無明顯作用。應(yīng)用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)，我們觀察到Dact2

7、對(duì)Wnt信號(hào)通路具有明顯抑制作用。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果示Dact2再表達(dá)可能下調(diào)下游效應(yīng)蛋白c-myc、MMP-2。在體外實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步觀察了Dact2對(duì)裸鼠成瘤的影響，發(fā)現(xiàn)Dact2能顯著抑制活體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)。
　　 結(jié)論: Dact2啟動(dòng)子區(qū)甲基化是胃癌發(fā)生發(fā)展中的好發(fā)事件，可能參與下調(diào)了Dact2基因的表達(dá)；Dact2啟動(dòng)子區(qū)甲基化可能通過減弱對(duì)Wnt信號(hào)通路抑制作用影響胃癌發(fā)生發(fā)展，并可能成為診斷胃