HOXA11在胃癌中的表觀遺傳學調控及其在Wnt信號通路中的功能研究.pdf

1、背景:胃癌(Gastric cancer)在全世界惡性腫瘤死亡病因中位居第二僅次于肺癌,其術后五年生存率仍然較低,因此尋找胃癌早期診斷的分子標志物,對提高胃癌早期診斷率非常重要。雖然遺傳學的異常改變在腫瘤發(fā)生中扮演重要角色,但是其不足以解釋胃癌的發(fā)生機制。隨著人們對表觀遺傳學研究的不斷深入,表觀遺傳在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用越來越受到人們的重視。同源盒基因A11(homeobox-containing A11,HOXA11)是發(fā)育過程中

2、相對保守的一個基因,主要起到調控胚胎發(fā)育、細胞分化和增殖的作用。在卵巢癌、宮頸癌、子宮內膜癌等多種腫瘤中均存在表達下調。但HOXA11的表觀遺傳學改變及其在胃癌中的作用目前尚不清楚。
　　目的:分析HOXA11在胃癌中的表觀遺傳學改變及其調控機制;探討HOXA11在胃癌的發(fā)生發(fā)展中的作用及機制。結合病人的臨床病理資料進行相關性分析,探討HOXA11甲基化能否可能成為胃癌的早期診斷和預后的標志物,并通過對HOXA11在胃癌中的功能研

3、究,探討HOXA11作為分子治療靶點的可能性。
　　材料與方法:對6株胃癌細胞系(AGS,NCI-N87,SGC7901,MGC803,BGC823,HGC27 and MKN45)應用半定量RT-PCR方法檢測甲基轉移酶抑制劑5-氮雜-2'-脫氧胞嘧啶(5-aza-2'-deoxycytidine、5-aza-dc)處理前后HOXA11的表達水平;應用甲基化特異性PCR(MSP)方法檢測6株胃癌細胞系、5例正常胃粘膜和112例胃

4、癌組織標本中HOXA11啟動子區(qū)CpG島的甲基化情況,并應用硫化測序方法驗證三種不同甲基化狀態(tài)的細胞系胞嘧啶甲基化改變情況。應用卡方檢驗方法分析HOXA11甲基化和胃癌臨床病理學特點的相關性,P<0.05認為具有顯著性差異。采用MTT和克隆形成實驗方法檢測轉染前后HOXA11對細胞生長的影響,應用流式細胞學實驗檢測HOXA11對腫瘤細胞周期及細胞凋亡的影響,應用基因芯片技術檢測HOXA11轉染前后AGS細胞系基因表達改變情況。結合文獻報

5、道及基因芯片篩選結果,對HOXA11調控的下游靶基因,進一步應用RT-PCR和western blot進行驗證。應用雙熒光素酶報告基因檢測和western blot方法,在胃癌細胞系AGS中,對HOXA11在下游信號通路的影響進行分析。對現(xiàn)有的45例配對的石蠟包埋的胃癌和癌旁組織,應用免疫組織化學染色(IHC)檢測HOXA11和磷酸化β-catenin表達水平,探討HOXA11和后者的相關性。
　　結果:六株胃癌細胞系中,AGS細

6、胞發(fā)生完全甲基化并且不表達,經甲基化酶抑制劑5-aza處理后,HOXA11恢復表達,MGC803和SGC7901是部分甲基化,其表達水平減低,經甲基化酶抑制劑5-aza處理后,HOXA11的表達水平升高。NCI-N87,BGC823,HGC27 and MKN45呈非甲基化狀態(tài),甲基化酶抑制劑5-aza處理前后表達水平無變化。以上結果表明,HOXA11的表達在胃癌中受甲基化調控。112例原發(fā)性胃癌HOXA11的甲基化率為81.25％(9

7、1/112),5例正常胃粘膜組織均為非甲基化。統(tǒng)計學分析表明HOXA11甲基化與性別、腫瘤組織大小及淋巴結轉移密切相關(P<0.05)。免疫組織化學染色表明HOXA11和磷酸化β-catenin在腫瘤組織標本中表達缺失或下調。MTT和克隆形成實驗結果表明HOXA11轉染組較空載組細胞增殖減慢,流式細胞學檢測表明恢復HOXA11表達細胞處于G2/M阻滯狀態(tài),細胞呈早期凋亡狀態(tài)。細胞劃痕實驗初步顯示HOXA11可以抑制細胞遷移能力,同時用腫

8、瘤細胞侵襲遷移實驗(transwell assay)進一步驗證,結果表明HOXA11可以降低AGS細胞的惡性侵襲和遷移?；蛐酒Y果顯示,恢復HOXA11表達可以引起199個基因表達上調,102個基因表達下調,其中Wnt信號通路的關鍵基因NKD1表達上調4.94倍。雙熒光素酶報告基因檢測結果顯示恢復表達HOXA11可以抑制經典WNT/β-catenin信號通路的活性而導致下游靶基因的蛋白表達減低(如c-myc和cyclinD1)。