Wnt-PCP信號(hào)通路與先天性小耳畸形發(fā)病表觀遺傳學(xué)機(jī)制的初步研究.pdf

1、目的:
　　從表觀遺傳學(xué)角度出發(fā)，對(duì)先天性小耳畸形殘耳軟骨組織及正常耳軟骨組織的全基因組DNA甲基化水平進(jìn)行對(duì)照研究，通過(guò)甲基化DEP和ROI深度分析，從中挖掘篩選出與生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)的Wnt信號(hào)通路，驗(yàn)證其相關(guān)甲基化差異基因Wnt1，Wnt11基因的表達(dá)差異，通過(guò)對(duì)Wnt/PCP通路的干預(yù)了解其在耳廓軟骨細(xì)胞增殖與凋亡中的作用，并結(jié)合甲基化水平的異常探討其在先天性小耳畸形發(fā)病中可能的作用機(jī)制。
　　方法:
　　1.通

2、過(guò)MeDIP Chip技術(shù)獲得先天性小耳畸形全基因甲基化譜并對(duì)其進(jìn)行深度GO和Pathway分析，篩選可能與本病相關(guān)的信號(hào)通路和相關(guān)分子。
　　2.對(duì)先天性小耳畸形患者和非耳畸形患者軟骨組織，及同一患者殘耳及正常軟骨組織中的wnt1和wnt11基因表達(dá)進(jìn)行Real-time PCR檢測(cè)，驗(yàn)證基因表達(dá)狀態(tài)是否與甲基化芯片中Wnt信號(hào)通路富集的結(jié)果相一致。
　　3.CCK-8法檢測(cè)同一先天性小耳畸形患者來(lái)源的正常軟骨和殘耳軟骨細(xì)

3、胞的增殖活性，AnnexinⅤ法檢測(cè)正常軟骨細(xì)胞及殘耳軟骨細(xì)胞的凋亡情況。
　　4.分別在同一先天性小耳畸形患者來(lái)源的正常軟骨和殘耳軟骨細(xì)胞組中加入JNKinhibitorⅡ、同時(shí)加入JNK inhibitorⅡ和5氮雜胞嘧啶苷，Real-time PCR檢測(cè)不同組間wnt1和wnt11基因表達(dá)的變化，Western Blot法檢測(cè)Wnt1和Wnt11蛋白含量的變化，確定Wnt/PCP信號(hào)通路被充分阻斷后，CCK-8法檢測(cè)各組正常

4、軟骨和殘耳軟骨細(xì)胞的增殖活性，AnnexinⅤ法檢測(cè)各組正常軟骨細(xì)胞及殘耳軟骨細(xì)胞的凋亡情況。
　　結(jié)果
　　1.對(duì)先天性小耳畸形DNA甲基化譜的深度分析，GO分析和Pathway篩選分析發(fā)現(xiàn)，Wnt信號(hào)通路是較為富集并且可能與本病發(fā)生密切相關(guān)的信號(hào)通路。其相關(guān)基因wnt1及wnt11在正常軟骨的啟動(dòng)子區(qū)和CpG島呈現(xiàn)高甲基化趨勢(shì)，而殘耳軟骨中甲基化水平較低。結(jié)合GO和Pathway的結(jié)果，構(gòu)建了存在甲基化差異表達(dá)的Wnt信

5、號(hào)通路Network。并針對(duì)該通路中存在甲基化改變的wnt1和wnt11基因及其所在的具體信號(hào)通路進(jìn)行進(jìn)一步研究。
　　2.對(duì)先天性小耳畸形患者和非耳畸形患者軟骨組織中wnt1及wnt11的基因表達(dá)均未見(jiàn)明顯差異。而對(duì)同一先天性小耳畸形患者來(lái)源的殘耳軟骨組織中的wnt11基因表達(dá)明顯高于正常軟骨組織。
　　3.同一先天性小耳畸形患者來(lái)源的正常軟骨和殘耳軟骨第3代細(xì)胞形態(tài)與原代及1、2代細(xì)胞無(wú)明顯差異。殘耳軟骨細(xì)胞的增殖能力和

6、凋亡情況與正常軟骨細(xì)胞相比未見(jiàn)明顯差異。
　　4.分別向殘耳軟骨細(xì)胞及正常軟骨細(xì)胞中加入JNK inhibitorⅡ和同時(shí)加入JNKinhibitorⅡ及5氮雜胞嘧啶苷后，第3代殘耳軟骨細(xì)胞及正常軟骨細(xì)胞的形態(tài)與對(duì)照組相比均沒(méi)有發(fā)生明顯的改變。通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR的檢測(cè)，殘耳軟骨細(xì)胞及正常軟骨細(xì)胞中JNK inhibitorⅡ組wnt11基因的表達(dá)均低于對(duì)照組。Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)殘耳軟骨細(xì)胞及正常軟骨細(xì)胞中JNK in

7、hibitorⅡ組Wnt11蛋白的表達(dá)均低于對(duì)照組。在Wnt/PCP信號(hào)通路被有效阻斷后，正常軟骨細(xì)胞和殘耳軟骨細(xì)胞JNKinhibitorⅡ組的增殖能力均高于對(duì)照組，其生長(zhǎng)曲線的擬合也與該結(jié)果相吻合。在細(xì)胞凋亡的測(cè)定中，JNK InhibitorⅡ組活細(xì)胞百分比明顯高于對(duì)照組，總凋亡細(xì)胞百分比明顯低于對(duì)照組。同時(shí)加入JNK inhibitorⅡ及5氮雜胞嘧啶苷組軟骨細(xì)胞的增殖與凋亡與對(duì)照組相比未見(jiàn)明顯差異。
　　結(jié)論
　　

8、先天性小耳畸形全基因組甲基化芯片的深度分析及篩選發(fā)現(xiàn)Wnt信號(hào)通路的DNA甲基化水平存在差異，選擇該通路中甲基化水平差異表達(dá)基因wnt1和wnt11基因進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證，在同一患者的配對(duì)研究中發(fā)現(xiàn)其殘耳軟骨中wnt11基因表達(dá)水平較其正常耳軟骨高。這與其啟動(dòng)子區(qū)CpG島DNA甲基化的狀態(tài)相一致。先天性小耳畸形患者殘耳軟骨細(xì)胞與正常軟骨細(xì)胞具有同等的增殖能力，可以作為組織工程耳種子細(xì)胞的來(lái)源選擇。在耳廓軟骨細(xì)胞中加入JNK inhibito