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文檔簡(jiǎn)介
1、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus,SLE)是一種常見(jiàn)的累及多系統(tǒng)、多器官的自身免疫性疾病。Th17細(xì)胞(T helper cell17,輔助性T細(xì)胞17)通過(guò)其主要效應(yīng)分子白介素(interleukin,IL)-17對(duì)SLE靶器官炎癥反應(yīng)的增強(qiáng)作用,進(jìn)而促進(jìn)了靶器官的炎性損傷和SLE的發(fā)生發(fā)展。特別是SLE腎損害患者中,Th17細(xì)胞異?;罨⑶疫^(guò)度分泌IL-17起著重要作用。但是,SLE腎損害Th
2、17細(xì)胞異?;罨头置贗L-17的確切機(jī)制還不完全清楚。近來(lái)的研究發(fā)現(xiàn),骨橋蛋白(Osteopontin,OPN)作為T(mén)h17細(xì)胞異?;罨脱仔砸蜃臃置诘闹匾{(diào)控器,在SLE疾病發(fā)生和靶器官炎性損傷中,特別是SLE腎損害中起著重要作用。
第1部分 ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在SLE患者表觀遺傳學(xué)基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制
背景:
我們擬利用流式、酶聯(lián)免疫、蛋白印跡、實(shí)時(shí)熒光定量PCR等技術(shù)研究體內(nèi)狼瘡T細(xì)胞中ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通
3、路和表觀遺傳學(xué)特征異常的內(nèi)在聯(lián)系,用特異性ERK信號(hào)通路抑制劑、DNMT抑制劑處理T細(xì)胞研究體外ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)狼瘡T細(xì)胞表觀遺傳學(xué)特征的影響,從而進(jìn)一步完善SLE發(fā)病機(jī)制中表觀遺傳學(xué)理論,為治療SLE提供新思路和新靶點(diǎn)。
目的:
通過(guò)研究紅斑狼瘡患者體內(nèi)ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與T淋巴細(xì)胞表觀遺傳學(xué)異常的內(nèi)在聯(lián)系以及體外ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)正常人T淋巴細(xì)胞表觀遺傳學(xué)特征的影響,探討ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在以DNA甲基化為
4、核心的表觀遺傳學(xué)基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制中的作用,進(jìn)一步完善SLE發(fā)病機(jī)制中表觀遺傳學(xué)基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制理論,為研究信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)表觀遺傳學(xué)基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制的影響提供新的思路,填補(bǔ)國(guó)內(nèi)外研究的空白,也為系統(tǒng)性紅斑狼瘡這一自身免疫性疾病的治療提供新策略和新靶點(diǎn)。
方法:
1.依據(jù)1997年修訂的SLE分類診斷標(biāo)準(zhǔn),分別收集10例SLE患者作為實(shí)驗(yàn)組和10例臨床資料匹配的健康體檢者作為對(duì)照組;
2.收集實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組外周
5、血,先用Ficoll密度梯度離心法分離出單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC),用免疫磁珠(Immunomagnet ic beads,IMB)分離技術(shù)分選CD4+T細(xì)胞,采用流式細(xì)胞技術(shù)(flow cytometry,F(xiàn)CM)檢測(cè)分選的CD4+T細(xì)胞百分比;
3.實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分選出的CD4+T細(xì)胞,分別用Trizol一步法和RIPA裂解液提取總RNA、DNA、蛋白質(zhì),儲(chǔ)存
6、備用;
4.設(shè)計(jì)人ERK1、DNMT1和CD70PCR引物,將提取的總RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄RCR(reversetranscription PCR,RT-PCR)擴(kuò)增,分析基因mRNA表達(dá)水平;
5.以5甲基胞嘧啶作為DNA甲基化的生物標(biāo)志物,利用印跡法DNA甲基化定量試劑盒(sigma,MDQ1,Amecica)檢測(cè)提取DNA的甲基化水平;
6.用蛋白質(zhì)印跡(Western blot)法檢測(cè)ERK1、DNMT1
7、和CD70蛋白水平;
7.采用IMB技術(shù)分離的人CD4+T細(xì)胞,分為ERK抑制組、DNNT抑制組、SLE和正常對(duì)照組共4組,分別加入特異性ERK抑制劑(U0126)、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(氮雜胞苷)共培養(yǎng)72小時(shí),而正常對(duì)照組未經(jīng)任何處理。后續(xù)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容同前4、5和6。
結(jié)果:
1.狼瘡T細(xì)胞中存在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)下調(diào)和DNA低甲基化。SLE患者外周血T細(xì)胞的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因1表達(dá)顯著低于健康對(duì)照組
8、;
2.系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血T細(xì)胞過(guò)度表達(dá)甲基化調(diào)控基因CD70。我們用Western Blot、RT-PCR等方法發(fā)現(xiàn), SLE患者CD70表達(dá)水平較正常人顯著增加;
3.DNA甲基化可以調(diào)控多種甲基化敏感基因表達(dá)。特異性DNA甲基化抑制劑氮雜胞苷與人外周血CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)可導(dǎo)致新合成的DNA甲基化水平明顯下降,DNA甲基化敏感基因CD70表達(dá)上調(diào);
4.狼瘡T細(xì)胞基因表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制異常與ER
9、K1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)。選擇性有絲分裂原活化蛋白/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶抑制劑U0126抑制正常T細(xì)胞 ERK途徑,減少T細(xì)胞DNMT1 mRNA和蛋白表達(dá)水平,誘導(dǎo)DNA低甲基化,進(jìn)而調(diào)控甲基化敏感基因CD70表達(dá)。
結(jié)論:
以DNA甲基化為核心的表觀遺傳學(xué)基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制在SLE疾病發(fā)生發(fā)展中起著重要作用
第2部分 ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在MRL/lpr鼠表觀遺傳學(xué)基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制中的作用探討
背景:<
10、br> SLE患者T細(xì)胞中ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路缺陷可能在SLE表觀遺傳學(xué)特征異常中起關(guān)鍵作用。因此,我們擬利用流式、酶聯(lián)免疫、蛋白印跡、熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等技術(shù)研究MRL/lpr鼠T細(xì)胞中ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和表觀遺傳學(xué)特征異常的內(nèi)在聯(lián)系,用特異性ERK信號(hào)通路抑制劑、DNMT抑制劑處理T細(xì)胞研究體外ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)MRL/lpr鼠T細(xì)胞表觀遺傳學(xué)特征的影響,從而進(jìn)一步完善SLE發(fā)病機(jī)制中表觀遺傳學(xué)理論,為治療SLE提供新思路和新
11、靶點(diǎn)。
目的:
通過(guò)研究MRL/lpr鼠體內(nèi)ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與T淋巴細(xì)胞表觀遺傳學(xué)異常的內(nèi)在聯(lián)系以及體外ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)T淋巴細(xì)胞表觀遺傳學(xué)特征的影響,探討ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在以DNA甲基化為核心的表觀遺傳學(xué)基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制中的關(guān)鍵作用,進(jìn)一步完善SLE發(fā)病機(jī)制中表觀遺傳學(xué)基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制理論,為研究ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)表觀遺傳學(xué)基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制的影響提供新的思路。
方法:
1.分別將10只
12、MRL/lpr鼠和10只健康BALB/e小鼠作為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組;
2.收集實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組脾臟單個(gè)核細(xì)胞,用免疫磁珠分離技術(shù)分選鼠CD4+T細(xì)胞,采用流式細(xì)胞技術(shù)(flow cytometry,F(xiàn)CM)檢測(cè)所分選的CD4+T細(xì)胞百分比;
3.采集鼠實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組外周血,先用Ficoll密度梯度離心法分離出單個(gè)核細(xì)胞(PBMC),再用免疫磁珠分離技術(shù)分選鼠CD4+T細(xì)胞,分別提取總RNA、DNA、蛋白質(zhì),儲(chǔ)存?zhèn)?/p>
13、用;
4.設(shè)計(jì)小鼠ERK1、DNMT1和CD70引物,將提取的總RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄RCR擴(kuò)增,分析各目的基因mRNA表達(dá)水平;
5.以5甲基胞嘧啶作為DNA甲基化的生物標(biāo)志物,利用印跡法DNA甲基化定量試劑盒(sigma,MDQ1,Amecica)檢測(cè)提取的DNA的甲基化水平;
6.用蛋白質(zhì)印跡(western blot)檢測(cè)ERK1、DNMT1和CD70蛋白水平;
7.采用IMB技術(shù)分離的鼠CD4+
14、T細(xì)胞,分為ERK抑制組、DNNT抑制組、SLE和正常對(duì)照組共4組,分別加入特異性ERK抑制劑(U0126)、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(氮雜胞苷)共培養(yǎng)72小時(shí),而正常對(duì)照組未經(jīng)任何處理。后續(xù)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容同前4、5、6。
結(jié)果:
1.MRL/lpr鼠T細(xì)胞中存在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)下調(diào)和DNA低甲基化。MRL/lpr鼠外周血T細(xì)胞的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因1表達(dá)顯著低于健康對(duì)照組;
2.MRL/lpr鼠外周血T細(xì)胞過(guò)
15、度表達(dá)甲基化調(diào)控基因CD70。我們用WesternBlot、RT-PCR等方法發(fā)現(xiàn),MRL/lpr鼠CD70表達(dá)水平較健康對(duì)照組顯著增加;
3.DNA甲基化可以調(diào)控多種甲基化敏感基因表達(dá)。特異性DNA甲基化抑制劑氮雜胞苷與MRL/lpr鼠外周血CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)可導(dǎo)致新合成的DNA甲基化水平明顯下降,DNA甲基化敏感基因CD70表達(dá)上調(diào);
4.狼瘡T細(xì)胞基因表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制異常與ERK1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)。選擇性有
16、絲分裂原活化蛋白/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶抑制劑U0126抑制正常T細(xì)胞ERK途徑,減少T細(xì)胞DNMT1 mRNA和蛋白表達(dá)水平,誘導(dǎo)DNA低甲基化,進(jìn)而調(diào)控甲基化敏感基因CD70表達(dá)。
結(jié)論:
以DNA甲基化為核心的表觀遺傳學(xué)基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制在SLE疾病發(fā)生發(fā)展中起著重要作用
第3部分 骨橋蛋白在SLE腎損害Th17細(xì)胞異常中的作用
背景:
Th17細(xì)胞及其分泌的多種炎性細(xì)胞因子在SLE疾病
17、的免疫紊亂及器官的炎性損傷中有非常重要的作用。有學(xué)者發(fā)現(xiàn),SLE患者外周血及受累器官Th17細(xì)胞及IL-17均高表達(dá)。而且在SLE活動(dòng)期其表達(dá)更高,而經(jīng)過(guò)治療后其表達(dá)有所降低。另外的學(xué)者則發(fā)現(xiàn),不僅SLE患者IL-17的分泌增加和分泌IL-17的CD4+和CD3+CD4-CD8-T細(xì)胞增多,而且分泌IL-17的Th17細(xì)胞也存在于SLE患者炎性損傷的腎組織中。
目的:
通過(guò)研究SLE腎損害患者OPN對(duì)CD3+CD8-
18、IL-17A+T細(xì)胞及IL-17分泌的影響,探討OPN在SLE腎損害患者Th17細(xì)胞異常中的作用。
方法:
分別取40例健康人和50例SLE患者(其中,伴腎損害SLE患者25例、無(wú)腎損害的SLE患者25例)血清和肝素鈉抗凝血,用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法檢測(cè)血清中OPN和IL-17的表達(dá)水平,用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血中CD3+CD8-IL-17A+T細(xì)胞的陽(yáng)性率,并分析各組間差異,以及各因素間的相互關(guān)系。
結(jié)論:
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