組織切片HE染色失敗原因的查找和補(bǔ)救措施的研究.pdf

1、目的:
　　常規(guī)蘇木素(Hematoxylin)和伊紅(Eosin)染色技術(shù)簡(jiǎn)稱HE染色技術(shù)。臨床患者或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的組織標(biāo)本通過(guò)固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、攤片、貼片、烤片、染色和封片等一系列操作技術(shù)，制成一張組織切片，這是各種病理技術(shù)的基礎(chǔ)。HE制片質(zhì)量在很大程度上影響病理醫(yī)師能否做出正確的病理診斷。優(yōu)質(zhì)的HE玻片標(biāo)本:在顯微鏡下觀察時(shí)應(yīng)該達(dá)到核質(zhì)清楚、紅藍(lán)分明、對(duì)比清晰。而制出大量?jī)?yōu)質(zhì)的切片并非易事，在常規(guī)病理制片的過(guò)程

2、中，經(jīng)常會(huì)遇到各種原因引起的組織脫水、透明、浸蠟不足、組織切片染色灰白、組織結(jié)構(gòu)不清等問(wèn)題，導(dǎo)致染色失敗，特別是胃鏡活檢標(biāo)本、穿刺等小活檢組織標(biāo)本，由于組織小，一旦出現(xiàn)上述問(wèn)題，大多都無(wú)法補(bǔ)材。為避免再次發(fā)生此類事件，需及時(shí)查明失敗原因，積極補(bǔ)救和調(diào)整。在本研究中，我們通過(guò)多次試驗(yàn)，終于找出切片染色失敗的主要原因，即脫水機(jī)處理組織不當(dāng)。在此基礎(chǔ)上，我們進(jìn)行了染色失敗標(biāo)本補(bǔ)救措施的研究:①對(duì)染色灰白的原切片退掉蓋玻片以后重新處理，②對(duì)組織

3、處理不當(dāng)?shù)南瀴K重新切片后處理切片后再?gòu)?fù)染。③是將處理不當(dāng)?shù)南瀴K組織經(jīng)二甲苯多次脫蠟，入梯度乙醇直至水化，然后將發(fā)軟的組織進(jìn)行重新脫水處理。研究結(jié)果表明:補(bǔ)救措施③基本達(dá)到病理診斷的閱片要求，但存在較大風(fēng)險(xiǎn)，稍有不慎就會(huì)導(dǎo)致組織變脆變硬，制片困難;而補(bǔ)救措施①和②則能夠顯著提高病理切片的質(zhì)量，滿足了病理診斷的要求。
　　方法:
　　1.HE染色失敗原因的查找
　　收集HE染色失敗的20例病理標(biāo)本，其中包括胃鏡活檢標(biāo)本5例

4、、腸鏡活檢標(biāo)本5例、子宮內(nèi)膜標(biāo)本5例、肺穿刺標(biāo)本5例。同時(shí)收集近日工作中染色正常的20例標(biāo)本（胃鏡活檢標(biāo)本蠟塊5例、腸鏡活檢標(biāo)本蠟塊5例、子宮內(nèi)膜標(biāo)本蠟塊5例、肺穿刺標(biāo)本蠟塊5例），以及當(dāng)天免疫組織化學(xué)染色的20例HE切片進(jìn)行對(duì)比觀察。試驗(yàn)設(shè)計(jì)分為7組:HE染色失敗的標(biāo)本為染色失敗組;染色失敗的蠟塊組織利用4種方法進(jìn)行處理，為處理組1:切片后經(jīng)調(diào)節(jié)后的染色機(jī)程序再染色（延長(zhǎng)烤片時(shí)間）;處理組2:切片后經(jīng)調(diào)節(jié)后的染色機(jī)程序再染色（更換新蘇

5、木素和伊紅）;處理組3:切片后經(jīng)調(diào)節(jié)后的染色機(jī)程序再染色（延長(zhǎng)染色機(jī)中切片脫蠟和脫水時(shí)間）;處理組4:切片后經(jīng)正常的染色機(jī)程序染色，再調(diào)節(jié)封片用的中性樹(shù)膠濃度的玻片;同時(shí)，設(shè)立兩個(gè)對(duì)照組，正常HE染色對(duì)照組:正常程序處理的石蠟標(biāo)本切片經(jīng)正常的染色機(jī)程序染色;免疫組化對(duì)照組:染色失敗的石蠟標(biāo)本經(jīng)免疫組織化學(xué)染色程序后的HE切片。
　　2.染色失敗標(biāo)本補(bǔ)救措施的研究
　　利用上述染色失敗的20個(gè)標(biāo)本，將20例標(biāo)本利用3種方法分別

6、進(jìn)行處理。補(bǔ)救組1:將染色失敗的HE切片放入二甲苯中浸泡30 min，去掉覆在切片組織上的蓋玻片，然后將切片移到100％、95％、85％、70％的乙醇中各3min，切片水洗3 min。將水洗的切片放入盛300 ml蒸餾水的500 ml燒杯中進(jìn)行水浴加熱，將燒杯放入盛水的不銹鋼鍋中，用電爐或電磁爐加熱，水沸騰后繼續(xù)煮30 min，將燒杯冷卻至室溫后取出切片，將切片重新染色。補(bǔ)救組2:將蠟塊重新切片，將組織片貼片于防脫載玻片上，65℃烤片3

7、0 min，常規(guī)脫蠟至水化，將切片放入盛自來(lái)水的不銹鋼鍋中水浴加熱煮30 min，再進(jìn)行常規(guī)HE染色。補(bǔ)救組3:將蠟塊組織經(jīng)二甲苯多次脫蠟，入梯度乙醇直至水化，然后將發(fā)軟的組織進(jìn)行重新處理，即對(duì)蠟塊組織逆程序處理到原組織水化狀態(tài)，更新試劑后再次處理。同時(shí)，以染色失敗的原始標(biāo)本切片作為對(duì)照組。
　　結(jié)果:
　　1.HE染色失敗原因的排查
　　與染色失敗組相比，處理組1、2和4的組織染色灰白，組織結(jié)構(gòu)不清，無(wú)法滿足診斷要求

8、。與原始HE切片相比，其病理評(píng)分均無(wú)明顯差異(p＞0.05)。處理組3的病理評(píng)分盡管與原始切片相比，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異(p＜0.05)，但仍然不能滿足臨床病理診斷的要求。而正常HE染色對(duì)照組染色后鏡下見(jiàn)核質(zhì)清楚、紅藍(lán)分明、對(duì)比清晰，由此排除了烤片、染色機(jī)染色和封片等步驟的原因。此外，在免疫組化對(duì)照組中，染色失敗玻片經(jīng)免疫組織化學(xué)染色程序后HE切片染色效果基本等同于正常HE切片染色對(duì)照組。通過(guò)逐步排除，最終發(fā)現(xiàn)HE染色失敗的原因是自動(dòng)

9、脫水過(guò)程中病理組織脫水處理不當(dāng)引起的。
　　2.補(bǔ)救措施效果的評(píng)價(jià)
　　根據(jù)病理切片染色后的評(píng)分情況，本研究發(fā)現(xiàn)3種補(bǔ)救方法處理的切片染色效果均較好，鏡下見(jiàn)切片組織結(jié)構(gòu)清晰，色彩鮮艷，紅藍(lán)對(duì)比適當(dāng)，透明度好，完全達(dá)到了診斷標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)，與原始HE切片相比，其病理評(píng)分在統(tǒng)計(jì)學(xué)上均有明顯差異(p＜0.05)。但由于補(bǔ)救措施③僅適用于組織塊較大的標(biāo)本，且存在一定風(fēng)險(xiǎn)，有可能造成組織塊的損毀。而補(bǔ)救措施①和②在取得滿意染色效果的同時(shí)，

10、對(duì)組織標(biāo)本不造成任何影響，因此我們推薦使用補(bǔ)救措施①和②來(lái)處理工作中出現(xiàn)的類似問(wèn)題。
　　結(jié)論:
　　影響石蠟切片HE染色的因素貫穿于整個(gè)組織處理及染色過(guò)程中，從組織離體后的固定、脫水處理及染色過(guò)程的每個(gè)步驟均會(huì)對(duì)HE染色產(chǎn)生影響。標(biāo)本固定及染色過(guò)程導(dǎo)致的染色失敗問(wèn)題的解決，可通過(guò)逐一排查導(dǎo)致染色不良的因素，采取相應(yīng)的解決辦法及補(bǔ)救措施。
　　在本研究中，我們通過(guò)逐步篩查，發(fā)現(xiàn)了導(dǎo)致本次染色失敗的根本原因是組織脫水機(jī)處