兩種鰓金龜圍食膜及其結(jié)構(gòu)蛋白的分離鑒定.pdf

1、圍食膜(peritropic matrix，PM)是大多數(shù)昆蟲中腸內(nèi)壁的一層厚薄均勻的長管狀薄膜，成圓桶狀把腸腔和中腸壁細(xì)胞分開，自中腸前端一直延伸至后腸。它主要由幾丁質(zhì)和蛋白質(zhì)組成，是昆蟲中腸天然的防御體系，具有保護(hù)中腸上皮細(xì)胞、阻止有害物質(zhì)侵入和幫助消化等多種功能，是害蟲生物防治的潛在靶標(biāo)。鰓金龜是我國重要的地下害蟲，其幼蟲(蠐螬)在土壤中生活，取食植物的地下部分，并把周圍的土壤顆粒、病原微生物等物質(zhì)一同帶入消化道，因此圍食膜對(duì)蠐螬

2、的生長發(fā)育具有重要的作用。本文采用生化和分子生物學(xué)技術(shù)等手段，對(duì)華北大黑鰓金龜(Holmchin oblita)和暗黑鰓金龜(Holotrichia parallela)圍食膜的形態(tài)結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成進(jìn)行了研究，構(gòu)建了華北大黑鰓金龜中腸cDNA表達(dá)文庫，分離鑒定新的PM靶標(biāo)蛋白，明確其生理功能，并研究生物防治促進(jìn)因子對(duì)圍食膜的作用與影響，尋找生物防治新靶標(biāo)，為發(fā)展新的高效生物殺蟲劑和鰓金龜?shù)纳锓乐翁峁├碚撘罁?jù)。 1.通過光學(xué)顯微鏡

3、和電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，鰓金龜幼蟲圍食膜位于中腸兩端的兩個(gè)“液囊環(huán)”(sac-circles)之間，是一層厚薄均勻的長管狀薄膜，表面平滑致密，無孔無縫，具有一定彈性，但與鱗翅目昆蟲圍食膜相比，韌性較差，解剖時(shí)其圍食膜易破碎。應(yīng)用Bradford法和苯酚-硫酸法，測(cè)定華北大黑鰓金龜圍食膜蛋白含量為36.38％，糖含量為8.84％；暗黑鰓金龜圍食膜蛋白含量為38.26％，糖含量為9.08％。 2.SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)華北大黑鰓金龜

4、PM蛋白至少有28條多肽，暗黑鰓金龜比較清楚的PM蛋白帶有15條，而鱗翅目昆蟲粉紋夜蛾、甜菜夜蛾、棉鈴蟲和粘蟲PM蛋白分別有19、17、16和9條，與鱗翅目昆蟲圍食膜相比，華北大黑鰓金龜圍食膜蛋白種類相對(duì)較多。腸粘蛋白(insect intestinal mucin，IIM)是昆蟲圍食膜中的重要蛋白，而應(yīng)用TnPM-IIM特異性抗血清對(duì)華北大黑鰓金龜和暗黑鰓金龜圍食膜蛋白做Western blot檢測(cè)，未發(fā)現(xiàn)兩種鰓金龜圍食膜中有類似于鱗

5、翅目昆蟲的粘蛋白。 3.應(yīng)用QIAGEN公司的RNeasy Mini Kit、Oligotex mRNA Mini Kit以及Stratagene公司cDNA Synthesis Kit，成功構(gòu)建了華北大黑鰓金龜3齡幼蟲中腸cDNA表達(dá)文庫，原始文庫滴度為1.9×106pfu/mL，擴(kuò)增后滴度為1.4×109pfu/ml，文庫重組率為99.97％，插入片段在0.8-2.3kb之間，平均長度為1.6kb。 4.應(yīng)用West

6、ern blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)棉鈴蟲圍食膜蛋白多克隆抗體、粉紋夜蛾圍食膜蛋白多克隆抗體與華北大黑鰓金龜圍食膜蛋白之間有交叉反應(yīng)，并用這兩種抗體免疫篩選華北大黑鰓金龜中腸cDNA文庫，得到122個(gè)陽性克隆，測(cè)序及序列比對(duì)后得到Ho-Peritrophin1、Ho-Peritrophin2、Ho-Peritrophin3、Ho-Peritrophin4四個(gè)華北大黑鰓金龜圍食膜蛋白基因，Genbank登錄號(hào)分別是FJ393548、FJ393549、

7、FJ393550和FJ573145，最長讀碼框(ORF)分別編碼729、477、528和324個(gè)氨基酸，含有9、6、5和4個(gè)幾丁質(zhì)結(jié)合功能域(CBD)，不含粘蛋白功能域，含有1-4個(gè)N-連糖基化位點(diǎn)，N端不含有信號(hào)肽。Ho-Peritrophin1、Ho-Peritrophin2、Ho-Peritrophin4的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的酶切位點(diǎn)大部分位于CBD內(nèi)部，受到保護(hù)，不會(huì)被胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶降解。而Ho-Peritrophi

8、n3的第5個(gè)CBD下游區(qū)域富含大量的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的酶切位點(diǎn)。通過構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，Ho-Peritrophin1、Ho-Peritrophin2和Ho-Peritrophin3在大腸桿菌中分別表達(dá)出78、51和57KD的目的蛋白，幾丁質(zhì)結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明Ho-Peritrophin1和Ho-Peritrophin3具有幾丁質(zhì)結(jié)合活性。 5.從華北大黑鰓金龜中腸cDNA表達(dá)文庫中篩選得到了HoSP1和HoSP2兩種華北大黑鰓金

9、龜絲氨酸蛋白酶全長基因，在Genbank登錄號(hào)分別為FJ573146和FJ573147，開放閱讀框(ORF)長783和786bp，編碼260和261個(gè)氨基酸，均含有3對(duì)半胱氨酸殘基，與CzSP3相似性最高，分別為52.47％和51.52％，催化活性中心位于His80、Asp125、Ser215，His80、Asp125、Ser216。通過構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，HoSP1和HoSP2在大腸桿菌中表達(dá)出26.7kDa和27.1kDa的蛋白。篩選

10、得到了華北大黑鰓金龜羧酸酯酶基因HoCL，在Genbank登錄號(hào)為FJ573148，開放閱讀框(ORF)長1599bp，編碼532個(gè)氨基酸，含有3個(gè)半胱氨酸殘基，具有Ser207，Asp333和His422的催化活性中心，推導(dǎo)的蛋白質(zhì)分子量為59.5kDa，屬于B類羧酸酯酶。 6.以棉鈴蟲顆粒體病毒增效蛋白和熒光增白劑FB28為先導(dǎo)物，測(cè)定了其對(duì)華北大黑鰓金龜和暗黑鰓金龜圍食膜的作用和影響，發(fā)現(xiàn)棉鈴蟲顆粒體病毒增效蛋白在不同濃度