暗黑鰓金龜幼蟲中腸蛋白基因的分離及表達分析.pdf

1、暗黑鰓金龜（Holotrichia parallela Motschulsky），屬鞘翅目、金龜科，是分布廣泛的重要地下害蟲。幼蟲統(tǒng)稱為蠐螬，主要為害花生、馬鈴薯、山藥等作物，其中花生因蠐螬危害一般減產(chǎn)10％～30％，嚴(yán)重時減產(chǎn)60％～70％，甚至絕產(chǎn)，并造成花生品質(zhì)下降，嚴(yán)重制約著我國花生生產(chǎn)。昆蟲圍食膜(Peritrophic membrane，PM)是昆蟲天然的的物理屏障，是害蟲防治的靶標(biāo)。因此分離鑒定新的靶標(biāo)蛋白基因及其表達分析

2、，為進一步研究靶標(biāo)蛋白與殺蟲活性物質(zhì)作用的分子機制和探索環(huán)境友好型殺蟲劑控制蠐螬危害提供基礎(chǔ)。本研究通過構(gòu)建暗黑鰓金龜幼蟲中腸cDNA文庫，利用免疫篩選文庫的方法，獲得了350個陽性克隆，對其中3個編碼PM蛋白的cDNA進行了分析，并初步研究了Cry8Ea3蛋白對hpcda5表達在轉(zhuǎn)錄水平上的影響。
　　提取暗黑鰓金龜（H.parallela）幼蟲中腸總RNA，分離得到mRNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，利用Uni-ZAP XR載體，成

3、功構(gòu)建了高質(zhì)量的暗黑鰓金龜幼蟲中腸cDNA表達文庫。該cDNA文庫滴度為4.68×105pfu/mL，重組率為98.8％，擴增后文庫滴度達1.8×108pfu/mL，插入cDNA片段的平均大小為1.8kb。用圍食膜蛋白多克隆抗體分別對該文庫進行免疫篩選，共得到350個陽性克隆，經(jīng)測序后生物信息學(xué)分析得到3個全長基因hpcbp45、hpcda5、hpce19，分別編碼HpCBP45、HpCDA5和HpCE19蛋白。
　　分離獲得了編

4、碼圍食膜幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白的cDNA基因hpcbp45。該基因ORF為1923bp，編碼641個氨基酸。其編碼的蛋白HpCBP45 N-端具有21個氨基酸的信號肽序列，預(yù)期蛋白分子量為69.5kDa，等電點為4.29。包含8個具有peritrophin-A結(jié)構(gòu)特征的幾丁質(zhì)結(jié)合功能域(chitin binding domain，CBD)和3個N-聯(lián)糖基化位點，氨基酸序列可以用通式CX13-20-CX5-CX9-CX12-CX7-C表示（X代表

5、除半胱氨酸之外的其他氨基酸殘基），其中多個CBD的存在有利于蛋白質(zhì)-幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。hpcbp45基因在原核細胞中成功表達了與預(yù)期一致的69.5kDa融合蛋白，在真核酵母表達系統(tǒng)中由于糖基化作用，表達的重組蛋白HpCBP45分子量約100kDa，高于預(yù)測分子量。幾丁質(zhì)結(jié)合活性實驗表明HpCBP45具有很強的幾丁質(zhì)結(jié)合活性，只能被6M尿素和1％ calcofluor洗脫，屬于class3類PM蛋白。實時定量PCR實驗結(jié)果顯示hpcb

6、p45基因在中腸中表達量最高，說明該類圍食膜是由中腸分泌，屬于TypeⅠ型PM。
　　分離得到編碼暗黑鰓金龜幼蟲羧酸酯酶的cDNA基因hpce19，該基因ORF為1605bp，編碼534個氨基酸，預(yù)期蛋白分子量為59.2kDa，等電點為4.19。經(jīng)NCBI網(wǎng)站Conserved Domain Database(CDD)分析表明，其編碼的HpCE19蛋白序列包含有Esterase/lipase superfamily（酯酶/脂肪酶超

7、家族）的保守結(jié)構(gòu)域。經(jīng)ExPASyProteomics Server網(wǎng)站ScanProsite分析，含羧酸酯酶B型絲氨酸活性位點FGGdpnkVtLaGySAG。ExPASy Proteomics Server網(wǎng)站SWISS-MODEL預(yù)測其蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)，并經(jīng)Pfam網(wǎng)站分析其蛋白活性中心包括3個氨基酸殘基（催化三聯(lián)體:Ser203，Asp334，His438）。NetNGlyc1.0 Server預(yù)測在第257、408和448位氨基

8、酸分別含有N-聯(lián)糖基化位點。hpce19在畢赤酵母GS115中得到成功表達，表達59kDa左右的目的蛋白，與預(yù)期一致。以α-醋酸萘酯溶液為底物檢測HpCE19活性顯示平均酶活力為0.21 mmol/100μL酶液。實時定量PCR表明羧酸酯酶基因hpce19在中腸中表達量最高，推測與昆蟲產(chǎn)生抗藥性相關(guān)。
　　篩選得到了編碼暗黑鰓金龜幼蟲幾丁質(zhì)脫乙酰酶HpCDA5的cDNA基因hpcda5，該基因ORF為1107bp，編碼379個氨基

9、酸，預(yù)期蛋白分子量為42.2kDa，等電點為4.08;信號肽軟件分析發(fā)現(xiàn)N-端具有19個氨基酸的信號肽序列。氨基酸序列分析表明HpCDA5含有1個幾丁質(zhì)脫乙酰酶結(jié)構(gòu)域和1個N-聯(lián)糖基化位點。Blast結(jié)果顯示其氨基酸序列與赤擬谷盜幾丁質(zhì)脫乙酰酶具有較高的相似性。hpcda5基因在原核細胞中獲得成功表達，表達約42kDa的目的蛋白。構(gòu)建重組桿狀病毒表達載體pFastBac-hpcda5，轉(zhuǎn)染昆蟲細胞sf9，分別獲得P1、P2、P3病毒，檢

10、測P3病毒證明hpcda5在昆蟲細胞sf9中獲得成功表達。幾丁質(zhì)結(jié)合活性實驗結(jié)果表明HpCDA5蛋白具有幾丁質(zhì)結(jié)合活性。實時定量PCR結(jié)果顯示hpcda5基因在卵中表達量最高，在脂肪體和蛻中表達量較高，而在頭部則不表達。RT-PCR檢測飼喂Cry8Ea3蛋白后hpcda5基因的表達變化，結(jié)果表明喂食Cry8Ea3蛋白后6h，hpcda5基因表達量顯著增高，8h之后恢復(fù)正常水平，表明飼喂Cry蛋白可以引起hpcda5基因表達在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)