暗黑鰓金龜性信息素滴度節(jié)律變化及嗅覺(jué)受體蛋白Or83b基因克隆的研究.pdf

1、暗黑鰓金龜Holotrichia parallela屬鞘翅目Coleoptera鰓金龜科Melolonthidae，其幼蟲(chóng)蠐螬為花生、大豆、玉米、小麥等作物的主要地下害蟲(chóng)，在中國(guó)、印度、日本、韓國(guó)等均有廣泛分布。受其危害花生一般減產(chǎn)20％～30％，嚴(yán)重地塊減產(chǎn)60％～70％，甚至絕收。為了控制其危害，長(zhǎng)期以來(lái)以化學(xué)藥劑防治為主，操作復(fù)雜，且易造成環(huán)境污染、破壞生態(tài)平衡等弊端，為了解決這些問(wèn)題，迫切需要開(kāi)發(fā)高效、環(huán)保、簡(jiǎn)便、節(jié)能的防治新技

2、術(shù)。利用昆蟲(chóng)信息素進(jìn)行成蟲(chóng)誘殺作為一種新型的安全防治手段能滿足上述要求。隨著國(guó)內(nèi)外幾位學(xué)者對(duì)暗黑鰓金龜性信息素分離鑒定工作的陸續(xù)進(jìn)行，利用性信息素防治暗黑鰓金龜?shù)玫搅顺醪降氖痉逗蛻?yīng)用。但在實(shí)際操作中，我們發(fā)現(xiàn)由于對(duì)暗黑鰓金龜性信息素分泌節(jié)律的不了解，導(dǎo)致性信息素在田間引誘昆蟲(chóng)時(shí)效果不穩(wěn)定等，所以現(xiàn)階段在暗黑鰓金龜性信息素應(yīng)用的過(guò)程中具有一定的盲目性。本研究在前期研究基礎(chǔ)上，利用氣相色譜法對(duì)暗黑鰓金龜性信息素組分分泌的時(shí)辰節(jié)律、日節(jié)律、求

3、偶期釋放節(jié)律以及交配對(duì)性信息素的影響等進(jìn)行深入研究，以期為田間性誘劑的科學(xué)使用提供理論依據(jù)。同時(shí)采用簡(jiǎn)并引物反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)和cDNA末端快速擴(kuò)增（RACE）技術(shù)，針對(duì)暗黑鰓金龜嗅覺(jué)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中重要的組成蛋白一嗅覺(jué)受體蛋白基因Hp-OR83進(jìn)行基因克隆并進(jìn)行相關(guān)生物信息學(xué)分析，為進(jìn)一步提高暗黑鰓金龜性信息素的利用效率與引誘效果，開(kāi)發(fā)新型高效安全的昆蟲(chóng)交配干擾劑提供理論依據(jù)。本文主要研究結(jié)果如下:
　　 1.暗黑

4、鰓金龜性信息素組分時(shí)辰節(jié)律的動(dòng)態(tài)變化.
　　 本試驗(yàn)在山東省花生研究所萊西試驗(yàn)站進(jìn)行，分別取2010年7月12日、7月28日和8月1日3天出土的試蟲(chóng)做重復(fù)，提取14:00至24:00的性腺體制備粗提物，開(kāi)展氣相色譜分析，結(jié)果表明暗黑鰓金龜性信息素組分L-異亮氨酸甲酯滴度呈先升高后下降的趨勢(shì)，最高值出現(xiàn)在19:00，為80.6μg/♀，最低值出現(xiàn)在24:00，為38.615μg/♀，該結(jié)果與暗黑鰓金龜在田間求偶行為在時(shí)間上一致;R

5、-(-)-芳樟醇滴度變化不顯著。
　　 2.暗黑鰓金龜性信息素組分日節(jié)律及兩種組分的滴度比研究
　　 本試驗(yàn)2010年7月26日至8月29日在山東省花生研究所萊西試驗(yàn)站進(jìn)行，隨機(jī)抽取7個(gè)出土日剛剛出土的處女蟲(chóng)腺體制備粗提物，開(kāi)展氣相色譜分析，并對(duì)這7個(gè)出土日兩種性信息素組分L-異亮氨酸甲酯與芳樟醇滴度之間的比值進(jìn)行研究，結(jié)果表明前5個(gè)出土日L-異亮氨酸甲酯滴度呈下降趨勢(shì)，最后2個(gè)出土日顯著降低;R-（-）-芳樟醇滴度變化

6、不明顯。進(jìn)一步對(duì)其比值進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)7個(gè)出土日L-異亮氨酸甲酯與芳樟醇比值逐漸降低，分別為12.1、12.4、10.7、8.91、9.02、7.71、3.27，這個(gè)比例解釋了按照同一比例在添加引誘效果不穩(wěn)定的情況，為性信息素在田間的合理使用提供理論基石出。
　　 3.暗黑鰓金龜處女蟲(chóng)求偶期性信息素的動(dòng)態(tài)變化.
　　 本試驗(yàn)對(duì)不同出土日處于求偶期的處女蟲(chóng)性信息素組分進(jìn)行氣相色譜分析，結(jié)果表明處女蟲(chóng)從出土?xí)r、伸出腺體到求偶結(jié)

7、束，L-異亮氨酸甲酯滴度呈極顯著下降趨勢(shì);芳樟醇的滴度出土?xí)r顯著高于求偶后期。
　　 4.暗黑鰓金龜交配過(guò)程中性信息素組分滴度的動(dòng)態(tài)變化及對(duì)性信息素合成的影響
　　 本試驗(yàn)對(duì)處于交配過(guò)程中的暗黑鰓金龜性信息素組分進(jìn)行氣相色譜分析，并對(duì)處女蟲(chóng)與田間試蟲(chóng)性信息素滴度進(jìn)行比較，結(jié)果表明交配對(duì)L-異亮氨酸甲酯滴度影響很大交配前、交配中、交配后滴度顯著降低，但R-（-）-芳樟醇滴度變化不顯著;處女蟲(chóng)L-異亮氨酸甲酯和R-（-）-芳

8、樟醇的滴度顯著高于同日出土的田間試蟲(chóng)，分別為1.56和1.79倍。
　　 5.暗黑鰓金龜嗅覺(jué)受體蛋白基因Hpar-Or83bcDNA克隆與序列分析
　　 采用簡(jiǎn)并引物反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)和cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)技術(shù)，從暗黑鰓金龜觸角克隆了一類非常保守的嗅覺(jué)受體蛋白基因（命名為Hpar-Or83b）全序列，結(jié)果表明暗黑鰓金龜Hpar-OR83b全長(zhǎng)共1684bp，其中5'-UTR為159bp，3'

9、-UTR為94bp，開(kāi)放閱讀框?yàn)?431bp。經(jīng)預(yù)測(cè)分子量為52.34kDa，等電點(diǎn)為7.52;Hpar-OR83b氨基酸序列中具有典型的G蛋白偶聯(lián)受體的7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)Hpar-OR83b氨基酸序列與已知的其它昆蟲(chóng)的Or83b具有較高的同源性，與鉛灰鰓金龜Holotrichia plumbea同源性最高為94％，其次為赤擬谷盜T.castaneum為80％;與其他昆蟲(chóng)同源性為62～68％。
　　 6.嗅覺(jué)受體蛋白系