梨小食心蟲幼蟲中腸胰蛋白酶活性、表達量及與生長發(fā)育的關系研究.pdf

1、梨小食心蟲Grapholitha molesta是一種世界性果樹重要害蟲，主要危害桃梢及桃、梨、蘋果等果實，其典型的季節(jié)性轉(zhuǎn)移寄主危害習性是引起梨小食心蟲常年猖獗成災的主要原因。昆蟲中腸胰蛋白酶在昆蟲取食消化和生長發(fā)育中起著重要作用。本研究以梨小食心蟲為研究對象，首先運用生化技術測定了梨小食心蟲幼蟲中腸蛋白酶的最適pH。在此基礎上，一方面用不同寄主植物飼喂梨小食心蟲，觀察其生長發(fā)育狀況，同時測定胰蛋白酶的活性，初步探明胰蛋白酶的活性在昆

2、蟲生長發(fā)育中的作用及寄主適應性。另一方面運用分子生物學技術克隆中腸胰蛋白酶基因，獲得其序列相關生物學信息，并通過實時熒光定量PCR技術測定其在取食不同寄主植物的梨小食心蟲體內(nèi)表達量，初步明確胰蛋白酶在昆蟲消化過程中的分子調(diào)控機制，為以昆蟲中腸蛋白酶為靶標的害蟲防治提供新思路。取得的具體研究結(jié)果如下:
　　(1)運用生化技術獲得在Tris-HCl，KH2PO4/NaOH和Glycine/NaOH3種緩沖液中，梨小食心蟲幼蟲中腸總蛋白

3、酶最適pH分別為10.5、11.0和11.0，強堿性胰蛋白酶的最適pH分別為10.5、11.0和11.0，弱堿性胰蛋白酶的最適pH分別為8.5、9.0和9.0。
　　(2)收集從田間采集到的桃梢、梨、木瓜、蘋果（秦冠）4種寄主植物和人工飼料飼養(yǎng)的蟲源取食蘋果（秦冠）、蘋果（嘎啦）、海棠、毛桃、油桃、李6種寄主果實的梨小食心蟲不同齡期幼蟲，發(fā)現(xiàn)其中腸總蛋白酶、強堿性胰蛋白酶、弱堿性胰蛋白酶活性存在差異顯著。
　　從田間4種寄主

4、植物上采集到的梨小食心蟲中腸3種蛋白酶活性均表現(xiàn)為4齡＞3齡＞5齡，其中從寄主梨上采集的梨小食心蟲3種蛋白酶活性最高，其次為木瓜。
　　室內(nèi)人工飼料飼養(yǎng)的梨小食心蟲取食6種不同寄主，其總蛋白酶活性在4齡差異顯著;強堿性胰蛋白酶活性差異顯著，活性表現(xiàn)為4齡＞3齡＞5齡;弱堿性胰蛋白酶活性無差異。
　　室內(nèi)人工飼料飼養(yǎng)的梨小食心蟲取食蘋果（秦冠）的總蛋白酶和強堿性胰蛋白酶活性大于取食蘋果（嘎啦）的活性。從田間寄主蘋果（秦冠）上采

5、集的梨小食心蟲總蛋白酶和強堿性胰蛋白酶活性小于用人工飼養(yǎng)的梨小食心蟲取食蘋果（秦冠）寄主的活性。
　　(3)室內(nèi)觀察人工飼養(yǎng)的梨小食心蟲取食蘋果（秦冠）、蘋果（嘎啦）、海棠、毛桃、油桃、李6種寄主果實及從田間寄主蘋果（秦冠）上采集梨小食心蟲取食蘋果（秦冠）的生長發(fā)育及繁殖狀況，發(fā)現(xiàn)其在不同寄主植物間存在顯著性差異。人工飼養(yǎng)的梨小食心蟲取食毛桃，其幼蟲期(9.79 d)、成蟲期(11.16 d)、幼蟲-成蟲總歷期(29.09 d)、

6、幼蟲存活率(38.66％)、羽化率(68.86％)、產(chǎn)卵量（50.0粒）和蛹重(8.96 mg)都比較低，但內(nèi)稟增長率rm較大;取食寄主蘋果（秦冠）的梨小食心蟲的化蛹率(98.13％)和單雌產(chǎn)卵量（67.8粒）大于取食寄主蘋果（嘎啦）;取食寄主李的梨小食心蟲的單雌產(chǎn)卵量（110.6粒）最高;取食寄主蘋果的單雌產(chǎn)卵量高于取食桃果。李是梨小食心蟲最適宜的寄主。
　　(4)利用分子生物學技術克隆出GMtrypsin-1與GMtrypsi

7、n-2兩個梨小食心蟲幼蟲中腸胰蛋白酶基因，其長度分別為861 bp和923bp，分別編碼257和259個氨基酸，預測分子量分別為27.98 kDa和27.93 kDa。氨基酸序列分析表明2個基因翻譯出的蛋白均含信號肽、催化三聯(lián)體His-Asp-Ser以及末端高度保守區(qū)RIVGG和GDSGGP，這些結(jié)構與胰蛋白酶所具有的特征一致。氨基酸序列同源性比對分析發(fā)現(xiàn)基因G Mtrypsin-1與大豆食心蟲Leguminivora glyciniv

8、orella的親緣關系較近，而基因GMtrypsin-2與其它鱗翅目昆蟲親緣關系相對較遠。
　　(5)實時熒光定量PCR技術檢測發(fā)現(xiàn)梨小食心蟲幼蟲中腸內(nèi)胰蛋白酶基因G Mtrypsin-1與GMtrypsin-2在取食不同寄主的梨小食心蟲體內(nèi)表達量存在顯著差異。在4齡時的表達量＞3齡＞5齡。從田間寄主蘋果（秦冠）上采集梨小食心蟲的Mtrypsin-1表達量高于人工飼料飼養(yǎng)梨小食心蟲取食蘋果（秦冠），而GMtrypsin-2表達量低

9、于后者。人工飼料飼養(yǎng)梨小食心蟲取食蘋果（秦冠），其2個基因的表達量均低于取食蘋果（嘎啦）。從田間寄主桃樹梢上采集的梨小食心蟲、人工飼料飼養(yǎng)取食蘋果（嘎啦）和油桃的梨小食心蟲幼蟲，2個基因的表達量都較高。
　　(6)綜合分析表明:胰蛋白酶活性影響梨小食心蟲歷期、蛹重、羽化率及產(chǎn)卵量等參數(shù)，促進梨小食心蟲的生長發(fā)育。梨小食心蟲中腸蛋白酶活性和胰蛋白酶基因表達量均表現(xiàn)為4齡＞3齡＞5齡。人工飼養(yǎng)的梨小食心蟲取食寄主李的GMtrypsin