二化螟幼蟲中腸蛋白質(zhì)組學(xué)分析及Cry1Ab結(jié)合蛋白的鑒定.pdf

1、二化螟Chilo suppressalis(Walker)是我國水稻上的重要鱗翅目害蟲，目前主要依靠化學(xué)藥劑防治，隨著化學(xué)農(nóng)藥的頻繁使用，抗藥性問題日益嚴(yán)重。Bt水稻的成功研發(fā)為二化螟防控提供了一種新型、安全和有效的方法。雖然Bt水稻在我國還未開始商業(yè)化種植，但研究靶標(biāo)害蟲對Bt水稻的潛在抗性風(fēng)險和抗性機(jī)理非常必要。昆蟲中腸既是主要的消化器官，也是外來不利因素(如毒素、農(nóng)藥、病原微生物等)的重要靶標(biāo)，而且昆蟲中腸BBMV受體的改變是Bt

2、抗性產(chǎn)生的重要機(jī)理。因此，本研究采用雙向電泳和質(zhì)譜技術(shù)對二化螟幼蟲的中腸蛋白質(zhì)成分進(jìn)行分離和鑒定，明確蛋白質(zhì)的基本類別和功能;然后結(jié)合配體雜交技術(shù)，分離并鑒定了二化螟中腸BBMV中的Cry1Ab結(jié)合蛋白。本文的研究結(jié)果對于研究Cry1Ab毒素的作用機(jī)理及二化螟對Cry1Ab毒素的抗性機(jī)理可提供重要的方法和技術(shù)儲備。
　　 1.二化螟幼蟲中腸蛋白質(zhì)組學(xué)分析
　　 通過雙向電泳分離二化螟5齡期幼蟲中腸蛋白得到300個左右的蛋

3、白點，這些點主要分布在pI值5-8、分子量10-100 kDa間的區(qū)域，酸性端的蛋白點數(shù)多于堿性端。從雙向電泳圖譜中選取較為明顯的103個蛋白點，使用胰蛋白酶進(jìn)行消化酶解，再通過基質(zhì)輔助激光解析離子化飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜(MALDI-TOF/TOF)分析，成功鑒定了71個蛋白點。
　　 鑒定獲得的71個蛋白質(zhì)分屬于47種蛋白或蛋白組分，根據(jù)這些蛋白質(zhì)在生物體內(nèi)生理功能的不同，將它們歸類為6種類型，分別為蛋白質(zhì)代謝(Protein m

4、etabolism)類、碳水化合物代謝(Carbohydrate metabolism)類、能量代謝(Energy metabolism)類、營養(yǎng)貯存(Nutrition storge)類、肌肉組成(Muscle related)類及其它蛋白等。
　　 2.二化螟幼蟲Cry1Ab結(jié)合蛋白的鑒定
　　 提取并分離了二化螟5齡幼蟲中腸的BBMV蛋白，使用Biotin-Cry1Ab進(jìn)行配體雜交后，對獲得的結(jié)合蛋白點進(jìn)行質(zhì)譜鑒定

5、。用Streptavidin-HRP對二化螟BBMV蛋白進(jìn)行結(jié)合分析檢測，發(fā)現(xiàn)二化螟BBMV蛋白中不合內(nèi)源性的生物素蛋白。通過雙向電泳和配體雜交技術(shù)獲得25個結(jié)合蛋白點，這些點主要分布在40-100 kDa之間。
　　 將雙向電泳圖譜和配體結(jié)合圖譜進(jìn)行匹配分析，對其中17個點進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。鑒定獲得的8種Cry1Ab毒素結(jié)合蛋白分別為肌動蛋白(Actin)、V-ATP酶亞基A(V-ATPase subunitA)、V-ATP酶亞基