克螟稻cry1Ab基因LAMP檢測(cè)方法研究.pdf

1、近年來(lái),許多轉(zhuǎn)基因生物進(jìn)入到中國(guó)市場(chǎng),轉(zhuǎn)基因生物對(duì)生態(tài)以及人類(lèi)健康帶來(lái)了潛在的危害。許多國(guó)家采取相應(yīng)的措施加強(qiáng)對(duì)轉(zhuǎn)基因生物和轉(zhuǎn)基因食品的監(jiān)管和標(biāo)識(shí),針對(duì)轉(zhuǎn)基因成分的快速、靈敏檢測(cè)也越來(lái)越重要、迫切。本論文以建立快速檢測(cè)cry1Ab基因的LAMP方法為主要研究目的,為快速檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植物以及轉(zhuǎn)基因食品提供技術(shù)支持。
　　環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)檢測(cè)作為一種新的核酸擴(kuò)增法,具有反應(yīng)溫度恒定、特異性高和反應(yīng)快速等特性。本研究以克螟稻中c

2、ry1Ab基因?yàn)槟０逶O(shè)計(jì)LAMP特異性引物,同樣區(qū)域設(shè)計(jì)常規(guī)PCR和熒光定量PCR引物用于構(gòu)建作為陽(yáng)性對(duì)照的重組質(zhì)粒與比對(duì)實(shí)驗(yàn)。對(duì)建立的LAMP反應(yīng)體系進(jìn)行條件優(yōu)化,確定其反應(yīng)體系為:0.2mmol/L內(nèi)引物(FIP&BIP),0.8mmol/L外引物(F3&B3),1.4mmol/LdNTPs,0.6M Betaine,8mmol/L MgSO4,10mmol/L KCl,20mmol/L Tris-HCl,10mmol/L(NH4)

3、2SO4,0.1％Triton X-100,8U Bst DNA Polymerase,1μL DNA模板,雙蒸水補(bǔ)足25μL總體積。在65℃保溫60min。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可通過(guò)以下三種方式鑒定:直接肉眼觀察白色沉淀或渾濁度變化;添加SYBR Green I熒光染料1μL,在紫外線照射下觀察是否發(fā)出綠色熒光;瓊脂糖凝膠電泳分析反應(yīng)產(chǎn)物有無(wú)梯形條帶。
　　對(duì)設(shè)計(jì)的cry1Ab基因的LAMP引物做了特異性和靈敏度試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,克螟稻品

4、種檢測(cè)呈陽(yáng)性,而所有非轉(zhuǎn)基因樣品和其他轉(zhuǎn)基因樣品均為陰性,結(jié)果與常規(guī)PCR和熒光定量PCR法一致,說(shuō)明LAMP引物特異性良好;以梯度稀釋陽(yáng)性對(duì)照重組質(zhì)粒DNA為模板,LAMP檢測(cè)法的靈敏度為3×102拷貝數(shù),與熒光定量PCR法相同,高于常規(guī)PCR的靈敏度(3×105拷貝數(shù))。植物基因組DNA快速提取方法的比較試驗(yàn)結(jié)果顯示,Triton X-100法提取植物基因組DNA條帶完整性更好,最接近試劑盒法提取的效果;并且Triton X-100

5、法提取基因組DNA相對(duì)操作簡(jiǎn)單,適合于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)用基因組DNA的快速提取。在實(shí)際樣品檢測(cè)中, LAMP快速檢測(cè)方法能檢測(cè)出轉(zhuǎn)基因成分為0.25%的混合的基因組DNA樣品,能從克螟稻不同組織中檢測(cè)出cry1Ab基因,結(jié)果與熒光定量PCR法一致。
　　通過(guò)在LAMP反應(yīng)體系中添加金屬熒光指示劑鈣黃綠素(calcein)和氯化錳,建立了克螟稻cry1Ab基因的可視化LAMP快速檢測(cè)方法。其中,最優(yōu)化的金屬熒光指示劑的終濃度為:10μM

6、 calcein,0.5mM MnCl2。反應(yīng)結(jié)果可以通過(guò)直接觀察反應(yīng)液的顏色變化來(lái)判斷。可視化LAMP檢測(cè)cry1Ab基因的特異性和靈敏度試驗(yàn)結(jié)果表明,克螟稻品種檢測(cè)的特異性良好;靈敏度為3×103拷貝數(shù)的陽(yáng)性對(duì)照重組質(zhì)粒DNA。研制了克螟稻cry1Ab基因的可視化LAMP快速檢測(cè)試劑盒,保質(zhì)期在4個(gè)月以上。
　　在實(shí)際樣品檢測(cè)中,克螟稻cry1Ab基因的可視化LAMP快速檢測(cè)方法能檢測(cè)出轉(zhuǎn)基因成分為0.5%的基因組 DNA樣品

7、,并對(duì)4種轉(zhuǎn)基因種粉末樣品中cry1Ab基因進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明:BT11玉米粉中檢測(cè)出約2.5%的cry1Ab基因成分,GT73油菜籽粉不含有cry1Ab基因成分,MON810玉米粉檢測(cè)出1-2.5%的cry1Ab基因成分,BT176玉米粉檢測(cè)出約1%的cry1Ab基因成分,結(jié)果與熒光定量PCR法和普通PCR法一致。
　　本研究分別建立了克螟稻cry1Ab基因的LAMP快速檢測(cè)方法與克螟稻cry1Ab基因的可視化LAMP快速檢測(cè)方