沙門(mén)菌屬stn基因LAMP快速檢測(cè)方法的研究.pdf

1、沙門(mén)菌是對(duì)人類和動(dòng)物健康都能構(gòu)成危害的一類致病菌，據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道，自二十世紀(jì)末以來(lái)，沙門(mén)菌對(duì)人類健康的威脅越來(lái)越大，已引起全球衛(wèi)生組織的重視。近年來(lái)，隨著進(jìn)出口貿(mào)易日益繁榮，也使得沙門(mén)菌的全球性傳播成為可能，致使口岸出入境樣本檢測(cè)工作量急劇增加;而各口岸出入境工作人員結(jié)構(gòu)組成復(fù)雜，流動(dòng)快，難以控制，因此建立快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法保證進(jìn)出口的安全性迫在眉睫。
　　本研究目的:擬以沙門(mén)菌腸毒素基因(Salmonella ent

2、erotoxin gene，stn)作為靶基因，建立檢測(cè)沙門(mén)菌的DNA環(huán)介導(dǎo)的恒溫?cái)U(kuò)增法《loop-mediated isothermalamplification of DNA，LAMP)，對(duì)沙門(mén)菌屬進(jìn)行特異性檢測(cè)，建立切實(shí)可行的快速沙門(mén)菌檢測(cè)技術(shù)并初步應(yīng)用。
　　方法:1.在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索沙門(mén)菌屬stn基因核苷酸序列，提交到PrimerExplorerV4設(shè)計(jì)相應(yīng)的LAMP引物，并通過(guò)Oligo6.0進(jìn)行分析，以確

3、保引物之間無(wú)二聚體形成;應(yīng)用BLAST程序，通過(guò)GenBank對(duì)引物及擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行同源性對(duì)比，經(jīng)篩選獲得特異性內(nèi)外引物各一對(duì)。
　　2.利用具有鏈置換活性的BstDNA聚合酶在恒溫條件下催化新鏈合成，使目的基因高效擴(kuò)增。
　　3.對(duì)LAMP反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，在反應(yīng)體系中添加SYBR-GreenⅠ熒光染料，結(jié)合顯色反應(yīng)，使結(jié)果觀察直觀準(zhǔn)確，能真正實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)快速簡(jiǎn)便檢測(cè)。
　　4.用沙門(mén)氏菌標(biāo)準(zhǔn)株和非沙門(mén)氏菌標(biāo)準(zhǔn)株

4、檢測(cè)方法的特異性和敏感性。與表型檢測(cè)方法顯色培養(yǎng)基法同時(shí)檢測(cè)肉、蛋、奶、水產(chǎn)品等樣品共計(jì)100份，檢測(cè)該方法的實(shí)用性。
　　結(jié)果:1.本研究建立的以沙門(mén)菌stn基因LAMP快速檢測(cè)方法，LAMP反應(yīng)體積25μl，在最佳擴(kuò)增溫度63℃恒溫條件下，時(shí)間60min內(nèi)完成對(duì)沙門(mén)氏菌的檢測(cè)。
　　2.檢測(cè)沙門(mén)氏菌DNA最低濃度極值為1fg/ml，檢測(cè)沙門(mén)氏菌菌液最低濃度極值為10cfu/ml。對(duì)沙門(mén)氏菌株陽(yáng)性檢出率100％，非沙門(mén)氏菌

5、株檢測(cè)均為陰性。
　　3.100份檢驗(yàn)、檢疫樣品檢測(cè)結(jié)果與表型檢測(cè)方法顯色培養(yǎng)基檢測(cè)結(jié)果對(duì)比，一致率100％。
　　結(jié)論:本研究建立了沙門(mén)菌屬stn基因LAMP檢測(cè)方法，并應(yīng)用于沙門(mén)菌屬標(biāo)準(zhǔn)株檢測(cè)及疑污染沙門(mén)菌的檢驗(yàn)檢疫樣品檢測(cè)中，結(jié)果表明該法敏感性、特異性高，簡(jiǎn)便快速，不需要昂貴的儀器設(shè)備，操作簡(jiǎn)單，不易出現(xiàn)DNA污染。加入熒光染料顯色后，結(jié)果更易于觀察。確實(shí)能達(dá)到快速檢測(cè)沙門(mén)菌的目的，是一種適合口岸及基層檢驗(yàn)、檢疫部門(mén)使