gyrB基因在沙門菌屬分類鑒別中的應用.pdf

1、沙門菌是一種革蘭陰性桿菌，具有鞭毛，兼性厭氧，能夠感染人類和動物，是引起食物中毒的主要病原菌。沙門菌可致多種疾病，輕者為自愈性胃腸炎，重者可引起致死性傷寒；沙門菌還能引起局部感染，此外還存在無癥狀的帶菌者。人類主要通過污染的食品和水源經口感染沙門菌，沙門菌感染只有少數是爆發(fā)，大部分(大于80％)是散發(fā)病例；全世界每年有數百萬人感染沙門菌并且有數千人因此而死亡。沙門菌感染已經成為人類健康的威脅，并給很多國家?guī)韲乐氐慕洕摀?沙

2、門菌屬是腸桿菌科細菌中最復雜的菌屬，家族龐大，所以其屬內分類顯得尤為重要。Kauffman-White根據沙門菌的O抗原、H抗原和Vi抗原將沙門菌分為不同的血清型，按此分類標準，至今已發(fā)現2500多種血清型。所有血清型的沙門菌均能引起人類感染，但對動物卻有宿主選擇性。少數沙門菌只感染一種或幾種動物，例如傷寒沙門菌只能感染靈長類，都柏林沙門菌只感染牛，豬霍亂沙門菌僅感染豬；當這些菌株感染人類的時候，往往是具有侵襲性的，甚至可威脅生命。然而

3、大多數血清型的沙門菌有廣泛的宿主。 根據DNA-DNA雜交結果，按親緣關系沙門菌被分為兩個種：腸炎沙門菌和邦戈爾沙門菌，每個菌種包括多種血清型。典型菌種腸炎沙門菌包括六個亞種：腸炎亞種Ⅰ型、薩拉姆亞種Ⅱ型、亞利桑那亞種Ⅲa型、第亞利桑那亞種Ⅲb型、豪頓亞種Ⅳ型、因迪卡亞種Ⅵ，邦戈爾沙門菌即為邦戈爾沙門菌亞種Ⅴ型。大多數(59％)血清型的沙門菌屬于Ⅰ型亞種(腸炎沙門菌腸炎亞種)，Ⅰ型亞種中最常見的血清型屬于A、B、C1、C2、D和

4、E群，這些血清型的沙門菌占人和溫血動物沙門菌感染的99％。腸炎沙門菌其它亞種和邦戈爾沙門菌多從冷血動物和環(huán)境中分離到，很少在人類感染中見到。 應用PCR技術，通過分析基因序列，可以確定細菌的進化關系和對細菌分類鑒定。常用的基因有16S/23SrRNA基因、管家基因和插入基因。16SrRNA基因普遍存在于各種細菌，細胞內含量豐富，保守區(qū)相對穩(wěn)定，不發(fā)生水平轉移，在特定生長情況下不發(fā)生適應性突變，是細菌鑒定和分類的理想選擇，已成為目

5、前細菌分類鑒別的金標準。然而對于一些進化距離相近的細菌，16SrRNA基因不能將其區(qū)分。 最近研究發(fā)現，蛋白編碼基因gyrB是細菌鑒定和分類的又一理想靶基因。gyrB編碼DNA解旋酶(gyrase)的B亞單位；細菌的解旋酶屬于Ⅱ型拓撲異構酶，由A、B兩種亞基組成活性單位A282。gyrB除了具備系統(tǒng)發(fā)育標記的特征外，一個顯著的優(yōu)點是基因的進化率較快，堿基替換頻率較高，能比16SrRNA基因序列更好地區(qū)分相似細菌，可用于細菌菌種水

6、平的鑒定。 本研究用PCR技術擴增沙門菌的gyrB和16SrRNA基因序列，并測序；測序結果用于細菌的系統(tǒng)發(fā)育分析和構建系統(tǒng)進化樹；通過與16SrRNA基因比較，評價gyrB基因在沙門菌屬分類鑒別中的應用。 材料與方法 1.經分離培養(yǎng)，形態(tài)學、手工生化、全自動細菌鑒定系統(tǒng)和血清凝集鑒定，收集10株不同血清型的沙門菌。 2.提取細菌基因組DNA，PCR擴增16SrRNA和gyrB基因序列，并測序。 3.將

7、測序結果與GenBank中的序列比對，并將測序得到的序列遞交到GenBank。 4.從GenBank獲得另外8株腸桿菌科細菌的16SrRNA和gyrB基因序列，與測序得到的序列一并用Clustalx軟件作多重序列比對。采用Kimura2-parametermodel計算進化距離。 5.根據比對結果，用Mega2軟件構建系統(tǒng)進化樹，計算方法為neighbor-joiningmethod，采用Bootstrap法評估進化樹，

8、Replications數為1000。 結果 1.手工生化鑒定和全自動細菌鑒定系統(tǒng)將沙門菌鑒定到屬的水平，血清凝集將沙門菌鑒定到血清型。 2.經PCR擴增并測序，獲得1.4kbp左右長度的16SrRNA基因序列和1.2kbp左右長度的gyrB序列。 3.6株沙門菌的16SrRNA基因和gyrB基因在GenBank中均存在序列；測序結果經與GenBank中序列比對，gyrB比對結果為5株相符，1株不相符，而16S

9、rRNA有3株相符，2株不相符，1株不能確定。 4.將測序得到的10株沙門菌的16SrRNA基因序列和gyrB序列遞交到Genbank，生成以下序列號：DQ344530～DQ344539和DQ344540～DQ344549。5.多重序列比對結果表明：基于gyrB序列的細菌間的相似性低于基于16SrRNA基因的相似性；而基于gyrB序列的細菌間的進化距離大于基于16SrRNA基因的進化距離。 6.16SrRNA基因和gyr