不同類型佐劑或聯(lián)合抗原對(duì)BALB-c小鼠免疫系統(tǒng)的作用.pdf

1、佐劑作為一種免疫增強(qiáng)劑，廣泛應(yīng)用于多種疫苗，而新型佐劑的不斷涌現(xiàn)也極大地推動(dòng)了疫苗的研發(fā)進(jìn)程。盡管使用佐劑的歷史已持續(xù)了近百年，然而其作用機(jī)制仍未得以完全闡明，這也為疫苗設(shè)計(jì)中合理選擇佐劑帶來(lái)了困擾。近年來(lái)藥物安全性評(píng)價(jià)技術(shù)有了巨大的發(fā)展和突破，但是對(duì)免疫系統(tǒng)安全性評(píng)價(jià)研究仍缺乏準(zhǔn)確、靈敏、有效的手段?；蛐酒夹g(shù)作為比較成熟的技術(shù)手段，在其他多種學(xué)科中應(yīng)用廣泛，將其用于免疫系統(tǒng)安全性評(píng)價(jià)具有一定的基礎(chǔ)，是未來(lái)免疫毒理學(xué)發(fā)展的一個(gè)重要方

2、向。
　　本研究選擇具有傳統(tǒng)經(jīng)典佐劑鋁佐劑和三種具有代表性的新型疫苗佐劑，使用基因芯片技術(shù)探究佐劑對(duì)免疫系統(tǒng)相關(guān)基因表達(dá)譜的影響，并結(jié)合免疫器官、免疫細(xì)胞、免疫分子、整體免疫功能等多個(gè)指標(biāo)，系統(tǒng)性地對(duì)機(jī)體免疫狀態(tài)進(jìn)行全面評(píng)價(jià)。同時(shí)，選擇不同類型佐劑聯(lián)合相同抗原進(jìn)行全面系統(tǒng)的免疫功能相關(guān)臨床前安全性評(píng)價(jià)，研究和闡明不同佐劑的作用機(jī)理，為疫苗設(shè)計(jì)和研發(fā)中合理選擇佐劑提供理論依據(jù)。
　　1.研究方法：
　　不同佐劑對(duì)免疫系統(tǒng)

3、的作用：雌性 BALB/c小鼠，8-10周齡，分別單次肌肉注射 PBS、不同劑量鋁佐劑（10，50，200mg/kg）和 MF59（0.5，2.5，10ml/kg），于給藥后1h、3h、6h和24h解剖并采血，對(duì)免疫相關(guān)臟器稱重并進(jìn)行組織病理學(xué)檢查；同時(shí)進(jìn)行T細(xì)胞依賴性抗體反應(yīng)（T cell dependent antibody response，TDAR）檢測(cè)、淋巴細(xì)胞亞群表型分析、外周血細(xì)胞因子檢測(cè)、小鼠脾臟基因表達(dá)譜分析等。

4、>　　不同佐劑結(jié)合同種抗原對(duì)免疫系統(tǒng)的作用：雌性 BALB/c小鼠，8-10周齡，分別單次肌肉注射PBS、H5N1滅活病毒（4μgHA）、H5N1（4μg HA）+不同劑量鋁佐劑（10，50mg/kg）、H5N1（4μg HA）+MF59（0.5，2.5ml/kg）、H5N1（4μg HA）+Poly(I:C)（0.25，10mg/kg）和H5N1（4μg HA）+CpG-ODN（0.1，5.0 mg/kg），于給藥后1h、3h、6h和

5、24h解剖并采血，對(duì)免疫相關(guān)臟器稱重并進(jìn)行組織病理學(xué)檢查；運(yùn)用紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)（hemagglutination inhibition test，HI）方法，檢測(cè)小鼠機(jī)體中H5N1抗體表達(dá)水平；同時(shí)進(jìn)行脾臟細(xì)胞亞群表型分析、外周血細(xì)胞因子檢測(cè)、小鼠脾臟基因表達(dá)譜分析等。
　　2.研究結(jié)果：
　　不同佐劑對(duì)免疫系統(tǒng)的作用：鋁佐劑和 MF59相對(duì)臟器系數(shù)均無(wú)顯著性變化，組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，給藥后6h MF59高劑量組脾臟偶見生

6、發(fā)中心易染體巨噬細(xì)胞數(shù)目增多，但病變程度輕且發(fā)病率低。TDAR檢測(cè)結(jié)果顯示，鋁佐劑對(duì)機(jī)體抗KLH特異性IgG抗體水平無(wú)顯著性影響，MF59則提高了機(jī)體抗KLH特異性IgG抗體水平。鋁佐劑對(duì)于小鼠脾細(xì)胞中CD69、CD86和CD11c的陽(yáng)性細(xì)胞比例的作用不顯著， MF59中高劑量在給藥后1h和3h，三種分子的陽(yáng)性細(xì)胞比例都有不同程度的降低。鋁佐劑對(duì)各細(xì)胞因子水平無(wú)顯著性影響，MF59能不同程度促進(jìn)Th2型細(xì)胞因子和趨化因子分泌。鋁佐劑和

7、MF59引起的脾臟基因變化與自身的生理變化類似，鋁佐劑對(duì)小鼠脾臟幾乎無(wú)免疫刺激作用，MF59上調(diào)與細(xì)胞因子分泌、免疫反應(yīng)相關(guān)介質(zhì)調(diào)節(jié)和白細(xì)胞遷移等相關(guān)基因，促進(jìn)免疫細(xì)胞向局部注射部位募集，但變化的差異基因數(shù)目較少。
　　不同佐劑結(jié)合同種抗原對(duì)免疫系統(tǒng)的作用：給藥后24h，Poly(I:C)和CpG-ODN脾臟重量顯著增加，其余組別無(wú)顯著性改變。組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，H5N1滅活病毒和各聯(lián)合佐劑組脾臟可見不同程度白髓易染體巨噬細(xì)胞數(shù)目

8、增多。HI抗體滴度檢測(cè)顯示，鋁佐劑、MF59和低劑量CpG-ODN有提高H5N1抗體表達(dá)水平的趨勢(shì)，MF59作用最強(qiáng)，Poly(I:C)和高劑量CpG-ODN則有降低H5N1抗體表達(dá)水平的趨勢(shì)。給藥后24h，單獨(dú)抗原組以及佐劑聯(lián)合抗原組均能上調(diào)小鼠脾臟CD86和CD69陽(yáng)性細(xì)胞比例。鋁佐劑、MF59和Poly(I:C)聯(lián)合H5N1均能促進(jìn)Th2型細(xì)胞因子和趨化因子分泌，而對(duì)促炎性細(xì)胞因子以及Th1型細(xì)胞因子無(wú)顯著性作用，且MF59的促進(jìn)

9、作用更強(qiáng)，而Poly(I:C)與H5N1聯(lián)合后對(duì)細(xì)胞因子分泌的促進(jìn)作用比單獨(dú)使用佐劑時(shí)減弱；CpG-ODN聯(lián)合H5N1對(duì)于趨化因子、Th1型細(xì)胞因子和Th2型細(xì)胞因子均有促進(jìn)分泌作用。四種佐劑與 H5N1聯(lián)合均能上調(diào)脾臟固有免疫應(yīng)答、防御病毒反應(yīng)等相關(guān)功能基因，但鋁佐劑和MF59差異表達(dá)基因數(shù)目較單獨(dú)抗原組減少，Poly(I:C)和CpG-ODN差異表達(dá)基因數(shù)目比單獨(dú)抗原組顯著增多，且Poly(I:C)差異表達(dá)基因涉及自身免疫病相關(guān)通路

10、。
　　3.結(jié)論：
　　鋁佐劑、MF59、Poly(I:C)和CpG-ODN均能增強(qiáng)機(jī)體免疫反應(yīng)。小鼠脾臟全基因表達(dá)譜分析結(jié)果與組織病理學(xué)檢查、免疫細(xì)胞亞群分析、細(xì)胞因子檢測(cè)、TDAR檢測(cè)等結(jié)果較為一致，與鋁佐劑和MF59相比，Poly(I:C)和CpG-ODN能夠激活機(jī)體細(xì)胞免疫反應(yīng)且作用更為強(qiáng)烈。四種不同類型佐劑與 H5N1抗原聯(lián)合使用：鋁佐劑和MF59能夠更好地激活體液免疫應(yīng)答；CpG-ODN能夠同時(shí)增強(qiáng)Th1型和Th