衣藻轉(zhuǎn)基因體系的構(gòu)建及添加不同碳氮源對(duì)衣藻生長(zhǎng)影響的研究.pdf

1、衣藻是一種可以進(jìn)行光合放氧作用的真核生物。它具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，培養(yǎng)成本低，絕大多數(shù)不含毒素、營(yíng)養(yǎng)豐富、分布廣泛、環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)、便于外源基因轉(zhuǎn)化等優(yōu)點(diǎn)，這些優(yōu)點(diǎn)已經(jīng)使衣藻成為比大腸桿菌和酵母等更為理想的基因工程宿主；而且隨著衣藻基因工程的發(fā)展，已有一批有應(yīng)用前景的外源基因得到成功表達(dá)，使轉(zhuǎn)基因衣藻可以在醫(yī)藥和環(huán)保問(wèn)題上得到應(yīng)用。 轉(zhuǎn)基因衣藻可以通過(guò)兩種方式獲得，即衣藻的葉綠體轉(zhuǎn)化和衣藻的核轉(zhuǎn)化。衣藻的葉綠體轉(zhuǎn)化，通過(guò)同源重組方式將外

2、源基因置換到衣藻葉綠體上，因此具有位點(diǎn)專(zhuān)一的同源重組、異源基因高效表達(dá)、母系遺傳等優(yōu)點(diǎn)，因此以衣藻葉綠體作為轉(zhuǎn)化受體表達(dá)異源基因成為轉(zhuǎn)基因工程研究中的又一熱點(diǎn)課題。衣藻的核轉(zhuǎn)化是通過(guò)外源基因隨機(jī)非同源整合方式整合到衣藻核染色體中，所以又可利用核轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的插入誘變來(lái)進(jìn)行必要基因或非必要基因的功能研究。本論文主要構(gòu)建帶有豆血紅蛋白基因的衣藻葉綠體轉(zhuǎn)化載體，可以嘗試將此豆血紅蛋白基因?qū)胍略迦~綠體中表達(dá)，在不影響衣藻正常生理代謝的情況下，以期

3、望得到的轉(zhuǎn)基因衣藻較之野生藻的氫氣產(chǎn)量有所提高。在本實(shí)驗(yàn)室內(nèi)通過(guò)衣藻核轉(zhuǎn)化體系來(lái)進(jìn)行高活性產(chǎn)氫酶的轉(zhuǎn)基因衣藻的篩選；同時(shí)檢測(cè)添加不同濃度碳源及氮源對(duì)野生型衣藻生長(zhǎng)狀態(tài)的影響，特別是在暗培養(yǎng)條件下衣藻的生長(zhǎng)狀態(tài)，為優(yōu)化野生型衣藻產(chǎn)氫培養(yǎng)條件做一些基礎(chǔ)工作。 本論文的主要內(nèi)容及結(jié)果如下： ①通過(guò)基因工程手段改造衣藻葉綠體轉(zhuǎn)化載體cg40，將其載體中所存在的單一多克隆酶切位點(diǎn)移動(dòng)到衣藻強(qiáng)啟動(dòng)子psbB與調(diào)控基因rbcL3’UT

4、R之間，并將改造好的載體命名為cg401。 ②通過(guò)基因工程手段改造衣藻葉綠體轉(zhuǎn)化載體cg401，將其載體中所存在的壯觀霉素表達(dá)盒aadA的終止子去掉，實(shí)現(xiàn)外源基因與aadA基因能夠串聯(lián)表達(dá)，將改造好的載體命名為cg40l-1。 ③從大豆總DNA中克隆出了豆血紅蛋白基因Lba、Lbc1、Lbc2，將壯觀霉素表達(dá)盒aadA基因經(jīng)雙酶切切下，把已克隆出的豆血紅蛋白基因插入劍cg401的psbB啟動(dòng)子的下游，成功構(gòu)建了穿梭表達(dá)載

5、體cg401-Lba、cg401-Lbc1、cg401-Lbc2，既可利用基因槍進(jìn)行衣藻光合基因突變株的互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)。 ④從大豆總：DNA中克隆出了豆血紅蛋白基因Lba、Lbc1、Lbc2，將其插入到載體cg401-1，的psbB啟動(dòng)子與壯觀霉素aadA表達(dá)盒(已去終止子)的下游，成功構(gòu)建了穿梭表達(dá)載體cg401-1-Lba、cg401-1-Lbc1、cg401-1-Lbc2，既可利用玻璃珠法或基因槍法進(jìn)行衣藻葉綠體轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。

6、 ⑤利用香港科技大學(xué)所贈(zèng)的適用于衣藻核轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒psp124s進(jìn)行衣藻核轉(zhuǎn)化，構(gòu)建衣藻核轉(zhuǎn)化體系，為大量篩選高產(chǎn)氫酶活性的衣藻突變株打下前期基礎(chǔ)，通過(guò)抗生素篩選及繼代培養(yǎng)，獲得大量核轉(zhuǎn)化突變株，并且對(duì)轉(zhuǎn)基因衣藻進(jìn)行了DNA水平的檢測(cè)，通過(guò)PCR方法，測(cè)定了質(zhì)粒pspl24s已成功轉(zhuǎn)化到衣藻中。 ⑥添加不同濃度的碳源和氮源在無(wú)光照條件下(對(duì)PSII進(jìn)行抑制)，對(duì)于衣藻生長(zhǎng)狀態(tài)的影響，即優(yōu)化衣藻暗培養(yǎng)培養(yǎng)條件。在本實(shí)驗(yàn)設(shè)置范圍內(nèi)，

7、葡萄糖的最適添加量為4g·L-1，甘氨酸的最適添加量為2g·L-1，尿素的最適添加量為0.5 g·L-1，最適的添加量組合為4g·L-1葡萄糖+2g·L-1甘氨酸+0.5g·L-1尿素的組合，但是未來(lái)的產(chǎn)業(yè)化培養(yǎng)及節(jié)約成本的角度出發(fā)，葡萄糖為對(duì)衣藻生長(zhǎng)促進(jìn)最大的外源物質(zhì)，最適添加量選為4g·L-1。 以上結(jié)果表明，構(gòu)建好的含有豆血紅蛋白基因的表達(dá)載體可以進(jìn)行衣藻葉綠體轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)；并建立了衣藻核轉(zhuǎn)化體系，得到一系列核轉(zhuǎn)化突變株；優(yōu)化