羧基化單壁碳納米管致大鼠肝、肺、腎纖維化作用及其分子機制的初步研究.pdf

1、單壁碳納米管(Single-walled carbon nanotubes，SWNTs)是由單層石墨卷曲而成的一維管形碳納米材料。SWNTs具備系列優(yōu)越的光學、電學等理化性質(zhì)，在納米藥物載體、近紅外熒光成像、疾病診斷以及腫瘤光熱治療等生物醫(yī)學方面的應用潛力很大，相關(guān)的研究是當前國際上重要的研究熱點之一。近年來，人們在SWNTs的生物醫(yī)學應用領(lǐng)域開展了大量的研究工作，取得了令人矚目的研究成果。
　　隨著SWNTs在各個領(lǐng)域的廣泛研究

2、和應用，它的潛在生物毒性越來越受到人們的關(guān)注，研究人員從動物、細胞和分子水平上對其生物毒性進行了大量的實驗研究。由于SWNTs屬于超細微顆粒，易分散到大氣環(huán)境中被呼吸道吸入，因此目前經(jīng)氣管滴注SWNTs引起的肺臟毒性作用及其機制的研究是其中最受關(guān)注和文獻報道最多的。然而，無論作為藥物載體，還是應用于體內(nèi)近紅外熒光成像進行疾病診斷，SWNTs的給藥方式均以靜脈注射為主。大量研究表明，SWNTs進入血液循環(huán)系統(tǒng)以后，主要積聚于肝、腎和肺。因

3、此，研究靜脈注射的SWNTs對肝、腎和肺的致纖維化等毒性作用，不僅能夠為SWNTs的生物醫(yī)學應用提供毒性依據(jù)，而且有助于進一步對SWNTs進行修飾以改善其生物兼容性。
　　目的:
　　1、評價尾靜脈注射羧基化單壁碳納米管(SWNT-COOH)對SD大鼠肝、肺和腎的致纖維化作用。
　　2、利用熒光定量PCR研究SWNT-COOH誘導的大鼠肝纖維化作用的相關(guān)基因mRNA的表達。
　　3、通過免疫組織化學實驗進一步探討

4、SWNT-COOH誘導的大鼠肝纖維化作用相關(guān)蛋白的表達情況。
　　4、評價尾靜脈注射SWNT-COOH對大鼠肺臟和腎臟的致纖維化作用，研究相關(guān)蛋白的表達。
　　方法:
　　1、SWNT-COOH的制備和動物實驗前表征:依次以混合強酸（濃硝酸和濃硫酸）加熱氧化、以超聲振蕩剪切SWNTs，制備在水中分散性良好的SWNT-COOH，經(jīng)透析除雜、超濾濃縮和Co60-γ射線輻照消毒，備用。以透射電子顯微鏡(TEM)和激光納米粒度

5、分析儀(LPSA)分別觀測和測定SWNT-COOH的形貌和粒徑大小，以電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀(ICP-OES)檢測SWNT-COOH分散液中的金屬含量，以紫外-可見分光光度計(UV-Vis)測定SWNT-COOH的濃度。
　　2、實驗分組和周期設(shè)定:取SD大鼠96只，隨機分為兩組，即空白對照組和SWNT-COOH實驗組，每組均為雌雄各半，尾靜脈注射給藥;設(shè)定1月、2月、3月和4月共4個周期，其中4月周期為給藥3個月后停藥1

6、個月。每天觀察和記錄大鼠的存活情況，每周稱量一次大鼠的體重并做好記錄。每個周期結(jié)束時，每組隨機抽取12只大鼠、雌雄各半，共24只，麻醉解剖，采集標本。
　　3、SWNT-COOH誘導的SD大鼠纖維化作用:采用蘇木素-伊紅染色法（HE染色法）評價SWNT-COOH引起的大鼠肝、肺、腎的病理變化;利用TEM觀測和研究SWNT-COOH對大鼠肝臟細胞超微結(jié)構(gòu)的影響。
　　4、應用實時熒光定量PCR(qPCR)分別測試、分析空白對照

7、組和SWNT-COOH給藥組的大鼠肝組織中肝纖維化相關(guān)基因mRNA的表達情況:包括平滑肌激動蛋白α2(ACTA-2)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)、Ⅰ型膠原蛋白(ColⅠ)和Ⅲ型膠原蛋白(ColⅢ)等。
　　5、應用免疫組織化學法分別檢測、分析空白對照組和SWNT-COOH給藥組的大鼠肝、肺、腎組織中肝纖維化相關(guān)蛋白的表達情況:包括平滑肌激動蛋白α2(ACTA-2)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)、Ⅰ型膠原蛋白(ColⅠ)和Ⅲ型

8、膠原蛋白(ColⅢ)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子2(TIMP-2)的表達。
　　結(jié)果:
　　1、經(jīng)氧化、剪切和純化后，SWNT-COOH在水中具有較好的分散性，TEM觀測和LPSA測試表明，SWNT-COOH的粒徑分布比較均一，團聚較少; SWNT-COOH的Z均粒徑為94.7nm，明顯變短。ICP-OES測試結(jié)果表明，用于動物實驗的SWNT-COOH樣品的Fe、Co、Al、Cr、Cu、Ni等金屬

9、含量均較低。
　　2、與空白對照組相比，SWNT-COOH給藥組的SD大鼠在2月周期死亡2只，4月周期時死亡1只，因此，給藥組累積死亡3只，死亡的大鼠出現(xiàn)明顯的腹部腫脹，解剖可見腹部積水。隨著給藥周期的增加，大鼠肝臟和肺臟黑染加深，大量SWNT-COOH在肝臟和肺臟沉積，停止給藥1個月后，黑染變淺。
　　3、大鼠肝臟切片經(jīng)HE染色，在光學顯微鏡下觀察可見SWNT-COOH給藥組匯管區(qū)血管周圍炎癥細胞浸潤，并伴隨纖維化，并隨給

10、藥周期增加而加劇，呈周期依賴性。大鼠肝臟切片的TEM結(jié)果表明，空白對照組細胞核仁明顯，細胞器豐富，邊緣清晰;而給藥組細胞內(nèi)線粒體受損，胞漿區(qū)出現(xiàn)大量空泡，溶酶體內(nèi)可見SWNT-COOH，細胞間可觀察到膠原纖維束。
　　4、實時qPCR表明，與空白對照組相比，SWNT-COOH給藥組的肝纖維化相關(guān)基因ACTA-2、TGF-β、ColⅠ和ColⅢ的mRNA表達水平顯著上調(diào)。
　　5、免疫組織化學染色檢測和分析結(jié)果表明，與空白對照

11、組相比，SWNT-COOH給藥組的大鼠肝臟、肺臟和腎臟等組織的纖維化相關(guān)蛋白ACT-2、TGF-β、ColⅠ、ColⅢ、MMP-2和TIMP-2蛋白表達均上調(diào)。
　　結(jié)論:
　　1、SWNT-COOH具有損傷大鼠肝、肺和腎等臟器組織，并誘導纖維化的生物毒性作用。
　　2、其可能機制為，SWNT-COOH大量沉積于大鼠肝、肺和腎，被這些組織細胞吞噬，損傷線粒體和溶酶體，引發(fā)慢性炎癥，上調(diào)纖維化相關(guān)基因和蛋白表達，導致纖維