藏藥獨一味止血活性部位的研究.pdf

1、藏藥獨一味Lamiophlomis rotata(Benth.)Kudo為唇形科獨一味屬(genusLamiophlomis)植物，該屬一屬僅一種，曾隸屬與糙蘇屬(genus Phlomis)，藏語稱“大巴”、“打布巴”，生長于海拔3000m以上的碎石灘中，分布在甘肅南部、青海東南部、四川西北部、云南西北及西藏大部。其根及全草入藥，是我國藏、蒙、納西等民族民間常用藥之一?！端拇ㄖ兴幹尽芳啊对颇现参镏尽肪涊d其治療刀槍傷有奇效。1982年

2、起，蘭州醫(yī)學(xué)院的梁重棟教授開展了藏藥獨一味的基礎(chǔ)與臨床研究，至1992年研制了以其水提取物為主要組成的國家新藥獨一味片。中國藥典1995年版起相繼收載獨一味片、獨一味膠囊及獨一味藥材。獨一味及其制劑具有活血止痛、化瘀止血之功效，臨床廣泛用于各種手術(shù)后的止血鎮(zhèn)痛及婦科、口腔科出血性疾病的治療。 獨一味主要含以8-O-乙酰基山梔子苷甲酯為主的環(huán)烯醚萜苷及以木犀草素-7-O-葡萄糖苷為代表的黃酮類成分，中國藥典規(guī)定獨一味及其制劑需測定

3、總黃酮及木犀草素含量，但是獨一味鎮(zhèn)痛止血有效成分至今未能明確闡述。有些報道認(rèn)為黃酮、環(huán)烯醚萜苷以及其中的苯乙醇苷均可能是其鎮(zhèn)痛有效成分，而止血有效成分至今未見研究。近年來獨一味的臨床應(yīng)用及其二次開發(fā)十分火熱，有效成分的不明確極大的阻礙了新制劑的研制，也使得其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定缺乏依據(jù)，為了解決上述不足，提高獨一味及其制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，促進(jìn)新制劑和新工藝的開發(fā)，我們在這篇學(xué)位論文中進(jìn)行了以下一些創(chuàng)新性的研究(1)深入研究獨一味止血活性部位的化學(xué)

4、成分，分離鑒定了5個主要的環(huán)烯醚萜苷類化合物，同時運用單晶衍射技術(shù)闡明其中一個新化合物的絕對構(gòu)型，首次運用液質(zhì)聯(lián)用(HPLC-MS)技術(shù)快速分析獨一味及其制劑中的環(huán)烯醚萜苷類成分。首次建立一階導(dǎo)數(shù)分光光度法快速測定獨一味中止血活性部位總環(huán)烯醚萜苷的含量，對中國藥典中獨一味含量測定項作了有效彌補(bǔ)。 (2)創(chuàng)造性地采用大孔吸附樹脂結(jié)合聚酰胺柱色譜法成功實現(xiàn)獨一味中總黃酮、總環(huán)烯醚萜苷及大極性部分(主要以糖類成分為主)的富集分離，相關(guān)

5、工藝流程獲得國家發(fā)明專利，為藏藥獨一味的研究及二次開發(fā)打下了良好基礎(chǔ)。 (3)深入研究獨一味水提取物及其中的總黃酮、總環(huán)烯醚萜苷及大極性部分的止血作用。明確了獨一味水提取物及總環(huán)烯醚萜苷具有良好的止血作用，總環(huán)烯醚萜苷是其止血活性部位，總黃酮及大極性部分未見明顯的止血作用。 (4)初步闡明了獨一味具有促進(jìn)肝臟合成功能，提高動物血液中凝血酶水平及纖維蛋白原含量，從而發(fā)揮良好止血作用的機(jī)理。初步明確了獨一味總環(huán)烯醚萜苷的安全

6、性。 論文共分四個部分。 第一章藏藥獨一味研究概況及糙蘇屬植物化學(xué)成分研究進(jìn)展(1)藏藥獨一味的研究進(jìn)展：檢索大量文獻(xiàn)資料，從本草史載及考證，植物分類，藥材形態(tài)及資源，化學(xué)成分，藥理活性，臨床應(yīng)用，制劑研究開發(fā)，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等八個方面對藏藥獨一味進(jìn)行較為全面的綜述，并總結(jié)出問題與不足。 (2)糙蘇屬植物研究概況：對與獨一味原屬糙蘇屬進(jìn)行文獻(xiàn)綜述，詳細(xì)歸納了從全球60多個該屬植物中分類鑒定出的150多個化合物，以及鎮(zhèn)痛

7、、抗炎、抗氧化等10個方面的藥理活性，為獨一味新制劑的深層次開發(fā)及代用資源的尋找提供恩路。 第二章獨一味及其總環(huán)烯醚萜苷的止血作用和機(jī)理的研究以止凝血基礎(chǔ)理論為指導(dǎo)，采用小鼠斷尾出血時間(BT)，毛細(xì)管凝血時間(CT)，測定大鼠血液凝集參數(shù)(PT，APTT，TT，F(xiàn)IB)及肝功能和血脂參數(shù)。在肯定前人關(guān)于獨一味水提取物具有止血作用的基礎(chǔ)上，首次證明獨一味水提取物能顯著縮短大鼠凝血酶時間(TT)，增加纖維蛋白原時間(Fib)，具有

8、良好的明顯的量效和時效關(guān)系。首次比較了獨一味中總黃酮、總環(huán)烯醚萜苷以及以糖類成分為主的大極性部分的止凝血作用，證明其中總環(huán)烯醚萜苷為其止凝血活性部位，具有良好的量效和時效關(guān)系，總黃酮及大極性部分未見明顯止血作用。首次證明獨一味水提取物及總環(huán)烯醚萜苷能一定程度地促進(jìn)肝臟合成功能而不會增加膽固醇、甘油三酯等血脂參數(shù)水平，其止凝血作用可能與肝臟有關(guān)而與血脂等無關(guān)。實驗還對獨一味水提取物及總環(huán)烯醚萜苷的急性毒性進(jìn)行了初步探討。 第三章獨

9、一味止血活性部位化學(xué)成分研究(1)采用大孔樹脂結(jié)合聚酰胺色譜柱分離提取獨一味各活性部位：根據(jù)獨一味中各類成分理化性質(zhì)的不同，創(chuàng)造性地采用大孔吸附樹脂結(jié)合聚酰胺柱色譜法成功地實現(xiàn)了獨一味各類成分的富集分離，總黃酮部分得率為10.25％，其中的黃酮含量達(dá)64.97％；總環(huán)烯醚萜苷部分得率為19.77％，其中的環(huán)烯醚萜苷含量達(dá)66.92％；以糖類成分為主的大極性部分得率為44.30％。為藥理活性篩選提供了合格的材料。 (2)環(huán)烯醚萜苷

10、單體的分離與鑒定：利用硅膠柱層析及聚酰胺柱層析技術(shù)結(jié)合天然有機(jī)化學(xué)波譜技術(shù)，從獨一味止血活性部位總環(huán)烯醚萜苷中分離并鑒定了5個含量較高的環(huán)烯醚萜苷單體成分，分別鑒定為8-O-乙酰氧基山梔子苷甲酯(Ⅰ)、番木鱉苷(Ⅱ)、山梔子苷甲酯(Ⅲ)、phloyoside II(Ⅳ)和8-去羥基-山梔子苷(V)。其中化合物V為新化合物。采用X-單晶衍射技術(shù)結(jié)合Ms、1H NMR、13CNMR、HMQC、HMBC、NOE等確定該化合物C-1、C-5、C

11、-6、C-8和C-9的絕對構(gòu)型分別為(S)，(S)，(R），(R）和(R）。葡萄糖為椅式構(gòu)型，C-1’到C-5’ 5個手性碳原子分別為(R），(R），(S)，(R），和(R）構(gòu)像。 (3)獨一味環(huán)烯醚萜苷類成分的HPLC-PAD-APCI/MS定量定性分析：首次運用HPLC-PAD-APCI/MS技術(shù)分析獨一味中環(huán)烯醚萜苷類成分，采用5個標(biāo)準(zhǔn)化合物比對的方法，提出醋酸流動相下的HPLC-APCI-MS中環(huán)烯醚萜苷的質(zhì)譜行為規(guī)律：

12、C-4位羧基甲酯化的環(huán)烯醚萜苷一定出現(xiàn)[M-H]-，[M-H+33]-，和[M-H+60]-離子峰組合，相反C-4位羧基未甲酯化的環(huán)烯醚萜苷則只會出現(xiàn)[M-H]-準(zhǔn)分子離子峰。利用這種規(guī)律推定了獨一味中另外4個環(huán)烯醚萜苷的基本結(jié)構(gòu)。同時建立了獨一味中幾個重要環(huán)烯醚萜苷即8-O-acetylshanzhiside methylester，loganin，8-dehydroxy shanzhiside，phloyoside Ⅱ，和shanz

13、hiside methylester的HPLC定量分析方法。 第四章總環(huán)烯醚萜苷的含量測定及制備工藝研究(1)首次建立聚酰胺色譜柱結(jié)合一階導(dǎo)數(shù)分光光度法測定獨一味及其制劑中總環(huán)烯醚萜苷含量。以8-乙酰氧基山梔子苷甲酯為標(biāo)準(zhǔn)品，選擇聚酰胺色譜柱預(yù)先除去其中黃酮類成分，測定波長為250 nm，為獨一味質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的修訂作了有益嘗試。 (2)首次建立大孔樹脂吸附法富集純化獨一味止血活性部位總環(huán)烯醚萜苷的工藝。實驗比較了7種不同廠家