銅鋅超氧化物歧化酶的體外定向進(jìn)化及其作為安全標(biāo)記應(yīng)用于植物轉(zhuǎn)基因的研究.pdf

1、選擇標(biāo)記基因的安全性問(wèn)題是制約轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)業(yè)化的主要瓶頸之一。開(kāi)發(fā)生物安全標(biāo)記基因替代抗生素標(biāo)記基因成為解決轉(zhuǎn)基因植物安全性和促進(jìn)轉(zhuǎn)基因植物應(yīng)用的重要策略。本研究利用體外定向分子進(jìn)化技術(shù)對(duì)乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)Cu/Zn-SOD進(jìn)行改造，并對(duì)以獲得的高活力突變體基因?yàn)榘踩珮?biāo)記基因，百草枯(PO)為選擇劑建立新型安全篩選體系的可行性進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究。
　　 通過(guò)克隆乳酸克魯維酵母Cu/Zn-

2、SOD基因，并在PGK1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下與GFP基因融合，構(gòu)建YEplac195-PSGA，轉(zhuǎn)化釀酒酵母W303菌株。通過(guò)菌落PCR和熒光顯微觀察及添加PQ進(jìn)行發(fā)酵檢測(cè)，結(jié)果表明乳酸克魯維酵母Cu/Zn-SOD基因在釀酒酵母中成功表達(dá)。
　　 通過(guò)一步基因置換法構(gòu)建釀酒酵母sodl缺失菌株LM303。首次采用釀酒酵母sodl缺失菌株作為表達(dá)宿主，通過(guò)在CM-Ura培養(yǎng)基中添加1 mmol/L PQ制造高氧壓力，建立了Cu/Zn-SO

3、D的高效篩選模型。
　　 通過(guò)優(yōu)化易錯(cuò)PCR體系中Mn2+濃度，確定其最適濃度為0.5 mmol/L。經(jīng)易錯(cuò)PCR建立突變文庫(kù)進(jìn)行篩選，得到三個(gè)酶活力提高的突變體S1、S2和S3(S99R/A92G，S135P，D126N)，其酶活力分別是野生酶的2.6、1.5和1.2倍。運(yùn)用計(jì)算機(jī)三維結(jié)構(gòu)模擬，對(duì)氨基酸置換所導(dǎo)致的酶分子結(jié)構(gòu)變化和活力提高分子機(jī)制進(jìn)行了初步分析，結(jié)果表明局部靜電環(huán)境、內(nèi)部氫鍵相互作用及活性通道的大小和形狀對(duì)酶活

4、力提高產(chǎn)生了重要影響。
　　 將乳酸克魯維酵母來(lái)源的Cu/Zn-SOD和突變體S1(mSOD)基因與擬南芥谷胱甘肽還原酶葉綠體信號(hào)肽(Chl)融合，構(gòu)建植物表達(dá)載體pBI121-Chl-SOD和pBI121-Chl-mSOD，并通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法成功轉(zhuǎn)化煙草，分別獲得再生植株35和46個(gè)株系。通過(guò)PCR、RT-PCR、葉綠體SOD活性測(cè)定證明目的基因已經(jīng)整合到煙草基因組中并正常定向進(jìn)入葉綠體表達(dá)。轉(zhuǎn)Chl-SOD和Chl-mSOD

5、植株的SOD活性分別是野生型植株的1.8倍和5.3倍。在PO和200 mmol/L NaCl處理下，考察其對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的表觀傷害、質(zhì)膜透性、葉綠素a熒光動(dòng)力學(xué)、抗氧化酶活性的影響，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因植株抗氧化能力和耐鹽能力有不同程度的提高，且提高大小順序?yàn)檗D(zhuǎn)Chl-mSOD植株>轉(zhuǎn)Chl-SOD植株>野生型植株。因此在煙草葉綠體中過(guò)表達(dá)乳酸克魯維酵母來(lái)源的Cu/Zn-SOD和突變體S1基因能夠提高轉(zhuǎn)基因植株的抗氧化能力和耐鹽能力。
　

6、　 建立了以乳酸克魯維酵母來(lái)源的Cu/Zn-SOD突變體S1(mSOD)基因作為選擇標(biāo)記基因，PQ作為選擇劑的新型安全篩選體系。將植物表達(dá)載體pBI121-Chl-mSOD中去除nptⅡ標(biāo)記基因表達(dá)盒，得到pBI121’。確定煙草遺傳轉(zhuǎn)化體系中PQ作為選擇劑的適宜濃度為6μmol/L。在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化煙草過(guò)程中，以mSOD基因作為選擇標(biāo)記基因，以6μmol/L PO為選擇劑，篩選得到96株表型正常的T0代轉(zhuǎn)基因植株。通過(guò)PCR

7、、Southern blot和RT-PCR對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明mSOD基因已整合到煙草基因組中，并獲得轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)。轉(zhuǎn)化頻率最高為39.26％，與以nptⅡ?yàn)檫x擇標(biāo)記基因，100 mg/LKan為選擇劑的傳統(tǒng)篩選體系進(jìn)行比較，轉(zhuǎn)pBI121-Chl-mSOD植株和轉(zhuǎn)pBI121’植株的轉(zhuǎn)化頻率分別是其2.16倍和2.1倍。對(duì)其遺傳穩(wěn)定性分析結(jié)果表明大多數(shù)T0代轉(zhuǎn)基因植株為單拷貝，且表現(xiàn)出3:1分離方式，符合孟德?tīng)柗蛛x定律。

8、
　　 通過(guò)測(cè)定種子發(fā)芽率、株高、葉片數(shù)等指標(biāo)，考察T0代和T1代轉(zhuǎn)基因植株對(duì)PQ誘導(dǎo)的氧化脅迫和鹽脅迫的耐受性。結(jié)果表明T0代和T1代轉(zhuǎn)基因植株對(duì)PQ誘導(dǎo)的氧化脅迫和鹽脅迫的耐受性明顯高于野生型植株。
　　 此新型安全篩選體系不僅避免了使用抗生素抗性標(biāo)記基因和抗除草劑標(biāo)記基因，對(duì)生態(tài)環(huán)境和人類相對(duì)安全，同時(shí)具有以下優(yōu)勢(shì)：轉(zhuǎn)化效率大大提高：獲得轉(zhuǎn)基因植株的周期縮短；選擇標(biāo)記基因可以同時(shí)為目的基因，提高轉(zhuǎn)基因植物對(duì)氧化脅迫