喉癌患者中醫(yī)體質類型分析及痰瘀對喉癌裸鼠miRNA表達影響的研究.pdf

1、目的:
　　喉癌是頭頸部常見惡性腫瘤之一，其發(fā)病率、死亡率較高，嚴重威脅著人民的生命健康。中醫(yī)體質與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的相關性，目前關于體質與喉癌發(fā)生發(fā)展相關性的研究并不多見，探究與喉癌發(fā)生相關的中醫(yī)體質類型，對于臨床中調整患者體質偏頗，預防喉癌有著重要的意義。導師團隊經過20多年的研究，逐步發(fā)現(xiàn)并證實了痰瘀相關證候（血瘀證、痰證、痰瘀互結證）是喉癌形成的基本證型，揭示痰瘀相關證候與喉癌形成之間的基因學機制，有望為喉癌的藥物治

2、療提供準確靶點。本課題將通過臨床調查研究，探究喉癌患者的中醫(yī)體質類型特點，為喉癌的早期預防提供依據(jù);其次，將通過實驗研究，觀察痰瘀相關證候對喉癌裸鼠腫瘤生長的影響，并檢測miRNA在痰瘀相關證候裸鼠腫瘤模型上的差異表達情況，分析痰瘀相關證候影響喉鱗癌細胞增殖的基因學機制。
　　方法:
　　1.文獻研究
　　通過文獻回顧，總結中醫(yī)體質的概念、分型、影響因素等，分析中醫(yī)體質與發(fā)病的關系，回顧中醫(yī)體質與惡性腫瘤關系的研究進展

3、。
　　2.臨床研究
　　根據(jù)國醫(yī)大師王琦教授的“體質九分法”建立臨床病例觀察表，采用問卷調查法，根據(jù)嚴格的納排標準，納入喉癌組患者67例，來源于2014年1月-2017年2月期間在廣州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院就診并確診為喉癌的患者;對照組53例，來源于同期收集的廣州市白云區(qū)三元里社區(qū)健康居民。對兩組人群進行中醫(yī)體質評分，建立數(shù)據(jù)庫，判斷兩組人群的中醫(yī)體質類型，分析喉癌患者的中醫(yī)體質特點。
　　3.實驗研究
　　將

4、Hep-2喉鱗癌細胞進行培養(yǎng)、傳代;制作痰瘀相關證候（血瘀證、痰證、痰瘀互結證）裸鼠模型，并對模型進行評價;將生長狀態(tài)良好的Hep-2喉癌細胞接種到已造模成功的裸鼠右側腋窩部皮下，觀察各組裸鼠在體瘤生長情況;腫瘤取材后以MTT法檢測細胞活性，以高通量法檢測瘤體細胞中的miRNA表達情況，并通過實時定量PCR檢測目的基因表達情況。
　　成果:
　　1.臨床研究
　　對67例喉癌患者及53例健康對照組人群進行中醫(yī)體質分析，

5、兩組人群的體質類型總體比較有統(tǒng)計學差異（P＜0.05），說明兩組人群體質類型存在差異。同時，對每一體質類型分別進行比較，發(fā)現(xiàn)喉癌組瘀血質、痰濕質人數(shù)明顯多于對照組(P＜0.05)，喉癌組平和質人數(shù)明顯少于對照組(P＜0.05)。九種體質類型中除平和質外，其余八種皆為偏頗體質。喉癌組中平和質7例，占本組總人數(shù)的10.4％，偏頗體質60例，占89.6％;對照組中平和質27例，占本組總人數(shù)的50.9％，偏頗體質26例，占49.1％。
　

6、　調查還發(fā)現(xiàn)，八種偏頗體質既可單獨出現(xiàn)，也可與其他偏頗體質兼見，同時具有兩種及以上偏頗體質者稱為兼夾體質。喉癌組的60例偏頗體質中，屬單一偏頗體質者27例，占40.3％，屬兼夾體質者33例，占49.3％;對照組的26例偏頗體質中，屬單一偏頗體質者11例，占20.8％，屬兼夾體質者15例，占28.3％。喉癌組中瘀血質24例（包括單一瘀血質6例，瘀血質兼其他偏頗體質18例），對照組中瘀血質3例（包括單一瘀血質0，瘀血質兼其他3例），兩者比較

7、有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。喉癌組中痰濕質25例（包括單一痰濕質3例，痰濕質兼其他22例），對照組中痰濕質6例（包括單一痰濕質0，痰濕質兼其他6例），兩者比較有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。其余六種體質類型（氣虛質、陽虛質、陰虛質、濕熱質、氣郁質、特稟質）分別比較，無明顯統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　氣虛質、陽虛質、陰虛質為虛性體質類型，將兩組虛性體質者分別合并后，各體質類型人數(shù)由多到少排序為:喉癌組，虛性體質＞痰濕質＞瘀血質

8、＞濕熱質＞氣郁質＞平和質＞特稟質;對照組，平和質＞虛性體質＞濕熱質＞氣郁質＞痰濕質＞瘀血質＞特稟質。虛性體質者在兩組人群中均占有較大比例，喉癌組46.3％，對照組32.1％。
　　2.實驗研究
　　(1)完成了痰瘀相關證候（血瘀證、痰證、痰瘀互結證）裸小鼠模型的制作和評價:與對照組比較，血瘀證組裸小鼠出現(xiàn)了形體消瘦，時有寒戰(zhàn)，反應減弱，皮膚暗紅無光澤，耳、爪、尾部等出現(xiàn)瘀點瘀斑，背部青筋顯露，唇周暗紅，舌色紫黯等表現(xiàn)，以及體

9、重增長緩慢，攝食量、飲水量減少，尾出血時間和凝血時間（玻管法）顯著縮短等癥狀體征和實驗室指標的變化，符合血瘀證動物模型的特征性表現(xiàn);痰證組裸小鼠出現(xiàn)了肥胖、行動遲緩、嗜臥少動、喜扎堆、大便黏膩不成形等表現(xiàn)，以及體重增長加快，攝食量、飲水量減少，血脂顯著升高等癥狀體征和實驗室指標的變化，符合痰證動物模型的特征性表現(xiàn);痰瘀互結證組裸小鼠出現(xiàn)了形體稍胖，嗜臥少動，行動遲緩，蜷臥喜扎堆，皮膚暗紅色，耳、爪、尾部出現(xiàn)瘀點瘀斑，背部青筋顯露，唇周暗

10、紅，舌色紫黯，大便黏膩不成形等表現(xiàn)，以及體重增長緩慢，攝食量、飲水量顯著減少，尾出血時間和凝血時間（玻管法）顯著縮短，血脂顯著升高等癥狀體征和實驗室指標的變化，符合痰瘀互結證動物模型的特征性表現(xiàn)。
　　(2)將喉鱗癌細胞接種到四組裸鼠腋窩部皮下后成功成瘤。觀察各組裸鼠的在體瘤生長情況，血瘀證組裸鼠腫瘤生長速度較對照組加快，時間點出現(xiàn)在腫瘤接種后第20天（約第3周），痰證組、痰瘀互結證組裸鼠腫瘤生長速度與對照組比較無顯著差異。腫瘤接

11、種后第28天，三個模型組裸鼠的喉癌體積、喉癌重量與對照組比較，無顯著差異(P＞0.05)。
　　(3)通過MTT實驗檢測不同模型組裸鼠在體喉癌細胞的活性，血瘀證組、痰證組、痰瘀互結證組裸鼠在體喉癌細胞活性均高于對照組（P＜0.05）。
　　(4)高通量法測序結果:血瘀證組、痰證組、痰瘀互結證組喉癌裸鼠的喉癌細胞中均出現(xiàn)miRNA異常表達。血瘀證組、痰瘀互結證組與對照組比較，血瘀證組、痰瘀互結證組與痰證組比較，均有大量miRN

12、A表達上調或下調;而痰證組與對照組比較、血瘀證組與痰瘀互結證組比較，miRNA表達上調或下調數(shù)量相對較少。經去重復、文獻回顧篩選后初步確定10個miRNA為血瘀證、痰證、痰瘀互結證影響喉癌裸鼠喉癌細胞miRNA異常表達的目的基因，經PCR檢測證實有5個miRNA在模型組裸鼠喉癌細胞中出現(xiàn)顯著異常表達，分別為miR-27a-5p、miR-708-5p、miR-30c-5p、miR-22-3p、miR-19a-3p。血瘀證組、痰瘀互結證組與

13、對照組比較異常表達的miRNA相同:miR-27a-5p呈高表達;miR-708-5p、miR-30c-5p、miR-22-3p、miR-19a-3p呈低表達。痰證組與對照組比較:miR-27a-5p呈高表達，miR-708-5p呈低表達。
　　結論:
　　1.臨床研究
　　喉癌患者中醫(yī)體質類型以瘀血質、痰濕質為主，兼有較多虛性體質，據(jù)此推測喉癌的發(fā)生可能與瘀血質、痰濕質、虛性體質有關。
　　2.實驗研究

14、　　血瘀證、痰證、痰瘀互結證可使喉癌細胞活性增強、促進喉癌細胞增殖;在體外成瘤實驗中，血瘀證對喉癌細胞增殖促進作用更為顯著;血瘀證、痰證、痰瘀互結證促進喉癌細胞增殖的基因學機制可能是通過使喉癌細胞中的miRNA發(fā)生異常表達實現(xiàn)的:血瘀證、痰證、痰瘀互結證可使miR-27a-5p表達上調，從而促進喉癌細胞增殖，推測miR-27a-5p可能為促進喉癌細胞增殖的基因;血瘀證、痰證、痰瘀互結證可使miR-708-5p表達下調，血瘀證、痰瘀互結證

15、可使miR-30c-5p、miR-22-3p、miR-19a-3p表達下調，從而使喉癌細胞的增殖失去抑制作用，促進喉癌的發(fā)展，推測miR-708-5p、miR-30c-5p、miR-22-3p、miR-19a-3p可能為抑制喉癌細胞增殖的基因。
　　3.展望
　　調整體質偏頗，改善瘀血質、痰濕質、虛性體質對預防喉癌有著重要的意義。在喉癌的治療中，對血瘀證、痰證、痰瘀互結證的喉癌可有望通過“化痰祛瘀”法治療，以抑制喉癌細胞的增