產(chǎn)酸克雷伯氏菌HP1可溶性氫酶的分離純化及特性的研究.pdf

1、氫酶是微生物氫代謝過程中的關(guān)鍵酶，它催化分子氫的氧化與質(zhì)子還原(H2←→2H++2e-).對氫酶的研究不僅可以揭示微生物的生理代謝規(guī)律，而且對探索和利用微生物制取燃料氫有重要意義.產(chǎn)酸克雷伯氏菌HP1(KlebsiellaoxytocaHP1)是一株放氫活性較高的菌株，其培養(yǎng)條件簡單粗放，培養(yǎng)周期短，可以大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)，菌體產(chǎn)量高.本研究對K.oxytocaHP1的可溶性氫酶進行分離提純，并分析了影響可溶性氫酶放氫活性的條件，為進一步研

2、究該氫酶的結(jié)構(gòu)與催化機理奠定了良好的基礎(chǔ). 取菌泥20g懸浮于Tris-HCl緩沖液(30mmol/L，pH8.0)中.菌懸液經(jīng)超聲波處理(400W，破碎35s/次，間歇15s/次，共60次)，高速離心(8,000×g，15min)和超速離心(100,000×g，30min)后得到氫酶的粗提液.粗提液經(jīng)過20％硫酸銨和60％硫酸銨分部沉淀后，酶被提純了1.93倍.初步純化酶液經(jīng)過SephadexG-25脫鹽并超濾濃縮后，過DE

3、AE-SepharoseF.F.柱，采用連續(xù)梯度洗脫(0～0.4mol/LNaCl).收集含可溶性氫酶的洗脫液，經(jīng)過濃縮后，過SephacrylS-200柱.收集含可溶性氫酶活性的組份，再經(jīng)過濃縮脫鹽后，過TSK-DEAE柱，采用分部洗脫，用含有0.3mol/LNaCl的Tris-HCl緩沖液(pH8.0)沈脫氫酶.經(jīng)過3次柱層析分離純化后，氫酶被純化約200倍，得率為15.3％，氫酶的放氫活性為17.68μmolH2/min·mgpr

4、ot. K.oxytocaHP1可溶性氫酶催化放氫的最適溫度為30℃，當溫度超過65℃時，氫酶很快失活.氫酶催化的最適pH值為7.5，在pH5.0～7.5范圍內(nèi)，氫酶的活性隨著pH值的升高而增加，在pH7.5～10.0范圍內(nèi)，氫酶的活性隨著pH值的增加而降低.氧對氫酶活性有較大的影響，在用純氧飽和的緩沖液中，氫酶催化活性在3h內(nèi)失活50％以上.不同電子載體對氫酶的放氫活性有較大影響，甲基紫晶(MV)是氫酶催化放氫的最適人工電子