產酸克雷伯氏菌HP1氫酶過表達及耐氧機制的研究.pdf

1、氫是一種清潔的二次能源載體，因其環(huán)保、燃燒熱值高而備受關注。生物制氫可利用微生物將有機廢水、固體有機廢物等轉化為清潔的氫燃料，從而成為研究熱點。生物制氫包括暗發(fā)酵產氫、光發(fā)酵產氫及光-暗耦合發(fā)酵產氫。在微生物體內，生物氫的產生是通過氫酶復合體來介導的，其方向是一定的。在體外，氫酶催化H2(→)2H++2e-的可逆反應，具有應用于H2/O2燃料電池、體外光解水產氫等催化過程的潛力。
　　 產酸克雷伯氏菌HP1(Klesiella

2、oxytoca HP1)是一株具有耐氧產氫特性的高效產氫菌株。本文在對該菌株全基因組測序分析的基礎上，構建了氫酶結構大亞基hycE及小亞基hycG過表達的重組工程菌株，分析了重組菌株的氫酶活性、產氫效率及產氫速率。結果表明，在大亞基過表達的重組菌株中，產氫速率和產氫效率分別提高了90.5％、93.5％，氫酶放氫活性也提高了2.1倍。小亞基過表達使產氫速率和效率分別提高了31.7％、33.3％，氫酶活性提高了1.55倍。因此，氫酶的單亞基

3、過表達是提高暗發(fā)酵產氫的有效方法。此外，大亞基表達菌株的厭氧產氫效率達到3.43 mol-H2/mol-glucose，遠超過大腸桿菌等產氫菌。在有氧條件下，氫酶亞基過表達使得野生產酸克雷伯氏菌的產氫能力提高。
　　 本論文對K.oxytoca HP1氫酶的耐氧性進行了一系列的探究。氨基酸突變分析和蛋白三維結構模型分析顯示，氫酶大亞基蛋白上的一些表面氨基酸，尤其是位于氣體外部通道入口處的氨基酸，對氫酶的耐氧性有至關重要的作用。這

4、些結果表明K.oxytoca HP1氫酶的耐氧性和氧在酶蛋白內部氣體通道的進出情況密切相關，通過pH、氧濃度等環(huán)境因子對氫酶耐氧性的分析證實了這一假設。同時，被氧失活的氫酶在氧氣被移除后能恢復部分活性，表明K.oxytoca HP1氫酶的耐氧性還取決于氧氣通過氣體通道進入蛋白活性中心與分子氧在活性中心被還原的速率之間的動態(tài)平衡。另外，實驗過程中突變菌株G300E(GIy300被Glu代替)顯示出較高的耐氧產氫活性，這一結果表明氨基酸突變