產(chǎn)酸克雷伯氏菌HP1氫酶過表達(dá)及耐氧機(jī)制的研究.pdf

1、氫是一種清潔的二次能源載體，因其環(huán)保、燃燒熱值高而備受關(guān)注。生物制氫可利用微生物將有機(jī)廢水、固體有機(jī)廢物等轉(zhuǎn)化為清潔的氫燃料，從而成為研究熱點(diǎn)。生物制氫包括暗發(fā)酵產(chǎn)氫、光發(fā)酵產(chǎn)氫及光-暗耦合發(fā)酵產(chǎn)氫。在微生物體內(nèi)，生物氫的產(chǎn)生是通過氫酶復(fù)合體來介導(dǎo)的，其方向是一定的。在體外，氫酶催化H2(→)2H++2e-的可逆反應(yīng)，具有應(yīng)用于H2/O2燃料電池、體外光解水產(chǎn)氫等催化過程的潛力。
　　 產(chǎn)酸克雷伯氏菌HP1(Klesiella

2、oxytoca HP1)是一株具有耐氧產(chǎn)氫特性的高效產(chǎn)氫菌株。本文在對該菌株全基因組測序分析的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了氫酶結(jié)構(gòu)大亞基hycE及小亞基hycG過表達(dá)的重組工程菌株，分析了重組菌株的氫酶活性、產(chǎn)氫效率及產(chǎn)氫速率。結(jié)果表明，在大亞基過表達(dá)的重組菌株中，產(chǎn)氫速率和產(chǎn)氫效率分別提高了90.5％、93.5％，氫酶放氫活性也提高了2.1倍。小亞基過表達(dá)使產(chǎn)氫速率和效率分別提高了31.7％、33.3％，氫酶活性提高了1.55倍。因此，氫酶的單亞基

3、過表達(dá)是提高暗發(fā)酵產(chǎn)氫的有效方法。此外，大亞基表達(dá)菌株的厭氧產(chǎn)氫效率達(dá)到3.43 mol-H2/mol-glucose，遠(yuǎn)超過大腸桿菌等產(chǎn)氫菌。在有氧條件下，氫酶亞基過表達(dá)使得野生產(chǎn)酸克雷伯氏菌的產(chǎn)氫能力提高。
　　 本論文對K.oxytoca HP1氫酶的耐氧性進(jìn)行了一系列的探究。氨基酸突變分析和蛋白三維結(jié)構(gòu)模型分析顯示，氫酶大亞基蛋白上的一些表面氨基酸，尤其是位于氣體外部通道入口處的氨基酸，對氫酶的耐氧性有至關(guān)重要的作用。這

4、些結(jié)果表明K.oxytoca HP1氫酶的耐氧性和氧在酶蛋白內(nèi)部氣體通道的進(jìn)出情況密切相關(guān)，通過pH、氧濃度等環(huán)境因子對氫酶耐氧性的分析證實(shí)了這一假設(shè)。同時(shí)，被氧失活的氫酶在氧氣被移除后能恢復(fù)部分活性，表明K.oxytoca HP1氫酶的耐氧性還取決于氧氣通過氣體通道進(jìn)入蛋白活性中心與分子氧在活性中心被還原的速率之間的動態(tài)平衡。另外，實(shí)驗(yàn)過程中突變菌株G300E(GIy300被Glu代替)顯示出較高的耐氧產(chǎn)氫活性，這一結(jié)果表明氨基酸突變