耐底物腈水合酶高產(chǎn)菌選育及其產(chǎn)酶條件優(yōu)化.pdf

1、腈水合酶(Nitrile hydratase,EC4.2.1.84)是催化丙烯腈水合生產(chǎn)丙烯酰胺的重要生物催化劑,隨著丙烯酰胺的需求不斷擴大,高活性腈水合酶的制備成為生物催化法生產(chǎn)丙烯酰胺的核心技術(shù),也是目前的研究熱點之一。
　　本文通過對昌九農(nóng)科生產(chǎn)用的諾卡氏菌(Nocardia.sp)進行自然分離和誘變選育,將篩選到的腈水合酶高產(chǎn)菌株與耐底物的突變株進行原生質(zhì)體融合,結(jié)合抗藥性標記篩選方法,成功篩選出一株產(chǎn)腈水合酶能力較高并且

2、耐丙烯腈能力較強的融合菌株,并對融合菌株的發(fā)酵產(chǎn)酶條件進行初步優(yōu)化。具體研究內(nèi)容如下:
　　(1)對原始菌株NK0進行自然分離,篩選出了一株酶活穩(wěn)定在1200萬U/mL的菌株NK10。通過對原始菌株NK0進行熱和紫外雙重誘變,確定最佳誘變劑量為熱誘變5min、紫外誘變80s,獲得一株能耐受4％丙烯腈的突變株NK8。以NK10和NK8作為原生質(zhì)體融合的親本。
　　(2)腈水合酶雙親本菌株抗藥性標記的選擇。實驗利用藥敏試紙法,選

3、用13種藥敏試紙分別對腈水合酶高產(chǎn)菌株NK10和耐底物突變株NK8進行抗藥性測定,成功篩選出NK10和NK8的抗性標記。NK10抗性而NK8非抗性的藥物標記為林可霉素在濃度為5μg/mL,NK8抗性而 NK10非抗性的藥物標記則為卡那霉素濃度為75μg/mL。
　　(3)雙親本原生質(zhì)體融合及融合子的鑒定。利用單因素實驗探討制備兩親本原生質(zhì)體的酶解時間,結(jié)果表明菌株NK10的最佳酶解時間為30min,菌株NK8的最佳酶解時間為50m

4、in。利用化學PEG方法使雙親本原生質(zhì)體融合,通過影印法篩選得到20株融合子。對這20株融合子進行發(fā)酵培養(yǎng),篩選出一株酶活最高的融合子NK18。
　　(4)融合子 NK18發(fā)酵生產(chǎn)腈水合酶條件初步優(yōu)化研究。首先應用正交設(shè)計法篩選出了融合子NK18發(fā)酵培養(yǎng)的最佳pH、發(fā)酵周期、接種量和裝液量,在此基礎(chǔ)上采用Plackett-Burman(PB)設(shè)計法,對8種影響產(chǎn)酶的培養(yǎng)基組分進行評價,結(jié)果表明:葡萄糖、尿素、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀

5、含量是影響菌株產(chǎn)腈水合酶的主效因子。通過最陡爬坡實驗和旋轉(zhuǎn)中心組合設(shè)計獲得主效因子的最佳水平,建立菌株產(chǎn)腈水合酶的最佳工藝條件:起始pH為8.0、發(fā)酵周期54h、接種量12%、裝液量12%、葡萄糖22.62g/L、尿素9.76g/L、K2HPO41.22g/L、KH2PO41.268g/L味精1g/L,MgSO40.2g/L,DXL1mL/L。在此優(yōu)化條件下融合子腈水合酶的產(chǎn)量達到1280萬U/mL,較優(yōu)化前的549萬U/mL提高了2.