酯合成脂肪酶高產(chǎn)菌的選育及其產(chǎn)酶發(fā)酵調(diào)控的研究.pdf

1、非水相中脂肪酶催化的酯合成反應(yīng)已廣泛用于各種酯的合成，并且也成為近二十年來脂肪酶催化的研究熱點(diǎn)。由于并不是所有的脂肪酶都能催化非水相中的酯化反應(yīng)，造成了現(xiàn)有脂肪酶中能有效催化酯合成反應(yīng)的酶并不多，必須開發(fā)新的具有高酯合成活性的脂肪酶。 本文以獲得高酯活性脂肪酶為目標(biāo)，首先建立了一種能快速篩選具有酯合成能力脂肪酶的篩選和酶活測(cè)定方法，然后以一株根霉RhizopuschinensisY92為出發(fā)菌，采用離子束和亞硝基胍進(jìn)行誘變，以建

2、立的方法進(jìn)行初篩，最終篩選得到一株脂肪酶高產(chǎn)菌R.chinensisY92-M，并對(duì)其培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。深入研究了影響具有酯合成活性脂肪酶合成的主要因素，并對(duì)該菌所產(chǎn)胞內(nèi)脂肪酶進(jìn)行了詳細(xì)分析，揭示了全細(xì)胞脂肪酶水解與合成活力之間的關(guān)系，找到了控制酯合成活性脂肪酶大量合成的手段。針對(duì)絲狀真菌形態(tài)變化對(duì)生產(chǎn)的影響，詳細(xì)研究了搖瓶和發(fā)酵罐中形態(tài)變化對(duì)酶合成的影響。并將全細(xì)胞脂肪酶用于酯的合成和生物柴油的生產(chǎn)，具體內(nèi)容和結(jié)果： (1)

3、為了能篩選得到酯合成活性高的脂肪酶生產(chǎn)菌，本文建立了一種非水相中用于具有合成活性脂肪酶篩選和活力測(cè)定的新方法。該方法的原理是利用脂肪酶在正庚烷中催化對(duì)硝基苯酚棕櫚酸酯(pNPP)和乙醇之間的轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)，然后用NaOH溶液快速萃取生成的對(duì)硝基苯酚并在410nm檢測(cè)吸光度。該法與其它已經(jīng)報(bào)道的類似方法相比，所需儀器簡(jiǎn)單，底物廉價(jià)，操作簡(jiǎn)單，因此篩選效率得到了有效提高。 (2)以R.chinensisY92為出發(fā)菌，采用兩輪離子束注入

4、誘變，并結(jié)合亞硝基胍誘變，以所建立的方法作為初篩方法，以氣相測(cè)定酯合成能力作為復(fù)篩方法，篩選得到一株酯合成活性顯著提高的菌株R.chinensisY92-M，該菌單位菌體的合成活性由200U/g，提高到400U/g。 (3)為了進(jìn)一步提高該菌的產(chǎn)酶能力，對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。首先采用田口設(shè)計(jì)對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行了初步優(yōu)化，對(duì)四個(gè)培養(yǎng)基組成因素(麥芽糖、橄欖油、蛋白胨、和K2HPO4)和四個(gè)環(huán)境因素(搖床轉(zhuǎn)速、接種量、pH和裝液量)進(jìn)行

5、了考察，結(jié)果分析表明環(huán)境因素對(duì)產(chǎn)酶影響更顯著。通過響應(yīng)面對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)一步優(yōu)化得到最優(yōu)培養(yǎng)條件：接種量4.25×108spores/L，橄欖油2.37％(w/v)，裝液量21mL/250mL，蛋白胨4.06％(w/v)，麥芽糖0.5％(w/v)，K2HPO40.3％(w/v)，搖床轉(zhuǎn)速200r/min，pH5.5。預(yù)測(cè)全細(xì)胞脂肪酶的最大酶活產(chǎn)率為14349.2U/L，驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)在最優(yōu)條件下，R.chinensisY92-M產(chǎn)具有酯合成活性

6、全細(xì)胞脂肪酶可達(dá)13875U/L。 (4)通過培養(yǎng)基中添加不同類型、不同量的脂肪酸或脂肪酸酯，考察了發(fā)酵過程中全細(xì)胞脂肪酶水解活性與合成活性的關(guān)系。結(jié)果表明，全細(xì)胞的水解活性受各種脂肪酸和脂肪酸酯的誘導(dǎo)作用并不明顯，而碳鏈大于18的脂肪酸或者脂肪酸酯對(duì)全細(xì)胞合成活性有顯著的誘導(dǎo)作用，最高酶活力是未加油脂的培養(yǎng)基條件的17倍。 (5)對(duì)細(xì)胞各部分的蛋白組分的分析結(jié)果表明，胞內(nèi)脂肪酶具有水解活性而不具備合成活性。膜結(jié)合蛋白具

7、有很好的酯合成活性，同時(shí)也具有水解活性。該微生物對(duì)具有酯合成活性脂肪酶的調(diào)節(jié)既表現(xiàn)在酶量的調(diào)節(jié)，也表現(xiàn)在酶活性的調(diào)節(jié)。酶量的調(diào)節(jié)體現(xiàn)在具有酯合成活性的脂肪酶為典型的誘導(dǎo)型酶：當(dāng)誘導(dǎo)物三甘酯添加量大于20g/L時(shí)，能維持酶活在650U/g，當(dāng)誘導(dǎo)物量不足時(shí)酶活迅速下降；具有合成活性脂肪酶的高產(chǎn)的條件除必須有油脂添加外，細(xì)胞還必須與油脂充分接觸，解除這種接觸狀態(tài)，酶的合成即停止。酶活性的調(diào)節(jié)則體現(xiàn)在全細(xì)胞水解活力的變化上：具有高合成活性的全

8、細(xì)胞的水解活性并不高，而實(shí)際上具有合成活性的膜結(jié)合脂肪酶水解活力可達(dá)56U/mg。對(duì)不同培養(yǎng)時(shí)間的細(xì)胞各部分的蛋白組分的分析，推測(cè)造成全細(xì)胞表觀水解活力和合成活力不對(duì)應(yīng)的原因是膜結(jié)合脂肪酶存在變構(gòu)調(diào)節(jié)。 (6)研究了不同三油酸甘油酯添加量對(duì)產(chǎn)酶的影響，提出了油脂流加策略。搖瓶中采用油脂流加方式也可以使得酶活力保持在650U/g，酶活產(chǎn)率13000U/L肌左右，而油脂總添加量只需15g/L。發(fā)酵罐中的菌體生長(zhǎng)與產(chǎn)酶過程和搖瓶相比存

9、在較大差距，油脂補(bǔ)料發(fā)酵并不能達(dá)到搖瓶的產(chǎn)酶效果。 (7)通過對(duì)搖瓶過程和發(fā)酵罐過程中菌絲微觀和宏觀形態(tài)的觀測(cè)和分析，發(fā)現(xiàn)菌絲微觀和宏觀形態(tài)變化對(duì)膜結(jié)合脂肪酶的合成影響非常顯著。搖瓶過程中，聚集狀態(tài)(塊狀，球狀，固定化)下的菌絲直徑稍寬，菌絲生長(zhǎng)單位多，菌絲未出現(xiàn)分化現(xiàn)象；而松散狀態(tài)下的菌絲直徑稍窄，菌絲體到生長(zhǎng)后期出現(xiàn)分化現(xiàn)象，并有膈出現(xiàn)。聚集狀態(tài)細(xì)胞的酶活力是松散狀態(tài)細(xì)胞酶活的3倍，說明菌絲聚集有利于膜結(jié)合脂肪酶的合成。通過

10、對(duì)發(fā)酵罐中菌體形態(tài)變化以及發(fā)酵液流變特性的研究，發(fā)現(xiàn)小球狀菌絲細(xì)胞有利于產(chǎn)酶，而松散狀菌絲細(xì)胞不利于產(chǎn)酶。對(duì)發(fā)酵液流變特性的測(cè)定結(jié)果表明，球狀菌體下的發(fā)酵液流動(dòng)性要明顯好于松散狀菌體，有利于油脂的分散。載體固定化同時(shí)滿足了菌體形態(tài)呈聚集狀和細(xì)胞必須和油脂充分接觸兩個(gè)酶高產(chǎn)的必要條件，因此固定化細(xì)胞經(jīng)發(fā)酵罐培養(yǎng)后酶活能達(dá)到400U/g。 (8)為了驗(yàn)證R.chinensisY92-M所產(chǎn)全細(xì)胞脂肪酶在非水相中的催化能力，將該酶和兩

11、種具有高酯合成活性的商品化脂肪酶Novo435和AmanoPS-C的酯合成能力進(jìn)行比較，結(jié)果顯示Y92-M所產(chǎn)全細(xì)胞脂肪酶具有很好的酯合成能力。 (9)考察了該酶在正庚烷體系中催化脂肪酸乙酯的能力，當(dāng)直鏈脂肪酸濃度為0.6mol/L時(shí)，該酶對(duì)碳鏈大于6的脂肪酸有較好的選擇性，轉(zhuǎn)化率可達(dá)90％以上。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明，該脂肪酶與出發(fā)菌所產(chǎn)脂肪酶相比，在無溶劑體系中能有效催化辛酸乙酯和油酸乙酯的合成。還考察了該酶在無溶劑體系中合成生物柴