5-羥基-雌馬酚產(chǎn)生菌的分離、耐氧馴化及耐氧機制研究.pdf

1、大豆異黃酮(Soy isoflavones)是大豆等豆科植物在其生長過程中生成的一類次生代謝產(chǎn)物，其中染料木素和黃豆苷原為大豆異黃酮的主要成分。大豆異黃酮化學(xué)結(jié)構(gòu)與雌激素相似，能夠與雌激素受體結(jié)合，因此被稱為植物雌激素。大豆異黃酮具有抗癌、抗骨質(zhì)疏松，治療心血管疾病等多種生理功能。然而，目前大量研究證實，被攝入機體的大豆異黃酮可被寄居在胃腸道的微生物菌群降解為二氫黃豆苷原、四氫黃豆苷原、二氫染料木素、去氧甲基安哥拉紫檀素、雌馬酚和4-乙

2、基苯酚等不同代謝產(chǎn)物。
　　本研究從公雞新鮮糞樣中分離得到一株能在厭氧條件下對染料木素有轉(zhuǎn)化作用的短桿狀嚴(yán)格厭氧細菌菌株AUH-JLC257。經(jīng)16S rDNA序列分析，菌株AUH-JLC257與斯奈克氏菌Slackia equolifaciens DZE相似性為99.27％。利用紫外吸收光譜、ESI質(zhì)譜以及核磁共振氫譜和碳譜等，將菌株AUH-JLC257代謝底物染料木素后生成的產(chǎn)物鑒定為5-羥基-雌馬酚。通過手性高效液相色譜檢測

3、發(fā)現(xiàn)5-羥基-雌馬酚只有一個物質(zhì)峰，表明其對映體過量率為100％;通過旋光性測定發(fā)現(xiàn)，生成的5-羥基-雌馬酚為左旋-5-羥基-雌馬酚。通過對菌株轉(zhuǎn)化能力測定，發(fā)現(xiàn)菌株AUH-JLC257能高效轉(zhuǎn)化底物染料木素的最大濃度為0.6 mmol/L，平均轉(zhuǎn)化率為83.05％。菌株AUH-JLC257除對染料木素具有轉(zhuǎn)化能力外，還能將底物黃豆苷原轉(zhuǎn)化為雌馬酚。
　　為提高菌株AUH-JLC257的耐氧能力，對其進行長期耐氧馴化嘗試，最終獲得

4、一株在有氧條件下生長的耐氧突變株Aeroto-AUH-JLC2H-257。通過對比研究發(fā)現(xiàn)，與原出發(fā)菌株AUH-JLC257相比，耐氧突變株Aeroto-AUH-JLC2H-257在很多方面發(fā)生了改變。在菌體形態(tài)上，耐氧突變株Aeroto-AUH-JLC2H-257由原來的小短桿變?yōu)殚L絲;在生理生化特性上，耐氧突變株Aeroto-AUH-JLC2H-257增加了對葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、柳醇、纖維二糖、甘露糖、棉籽糖、海藻糖和七葉靈

5、的利用能力。
　　通過高效液相檢測發(fā)現(xiàn)，耐氧突變株Aeroto-AUH-JLC2H-257在有氧條件下不能將底物染料木素和黃豆苷原轉(zhuǎn)化為5-羥基-雌馬酚和雌馬酚，但可以將底物染料木素和黃豆苷原分別還原為二氧染料木素(DHG)和二氫黃豆苷原(DHD)。其中DHG和DHD分別為5-羥基-雌馬酚和雌馬酚生物合成的前體。此外，通過轉(zhuǎn)化動態(tài)研究發(fā)現(xiàn)，在有空氣氧的條件下，耐氧突變株Aeroto-AUH-JLC2H-257轉(zhuǎn)化底物染料木素或黃豆

6、苷原時，產(chǎn)物DHG和DHD均發(fā)生了回轉(zhuǎn)現(xiàn)象，添加還原劑回轉(zhuǎn)現(xiàn)象消失。另外，通過向培養(yǎng)基中添加還原劑可顯著提高耐氧突變株的有氧轉(zhuǎn)化能力。當(dāng)向培養(yǎng)基中添加0.1％的抗壞血酸時，耐氧突變株Aeroto-AUH-JLC2H-257可轉(zhuǎn)化染料木素和黃豆苷原的最大濃度分別為1.6 mmol/L和0.6 mmol/L，平均轉(zhuǎn)化率分別為79.37％和82.67％。
　　通過耐氧機制研究發(fā)現(xiàn)，耐氧突變株Aeroto-AUH-JLC2H-257耐受氧