應(yīng)用近紅外光譜鑒別耐甲氧西林金葡菌和甲氧西林敏感金葡菌的研究.pdf

1、目的：
　　耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)在燒傷科是最常見的一種致病菌，它因具有特殊的耐藥機制，使得β-內(nèi)酰胺類藥物及其抑制劑復(fù)合物失效。此外，MRSA感染具有快速的傳播性和強烈的致病性，并可導(dǎo)致膿毒血癥、感染性休克等嚴(yán)重的并發(fā)癥，給醫(yī)院和社會帶來沉重的負(fù)擔(dān)。目前臨床應(yīng)用的主流MRSA檢測方法是基于耐藥表型的檢測方法，但這些方法存在耗時長、操作繁瑣等缺點，不利于減少抗生素濫用現(xiàn)象;而基于耐藥基因的新型檢測方法存在價格昂貴、對

2、技術(shù)人員要求高等缺點，限制了該技術(shù)的推廣。所以建立一種快速、準(zhǔn)確、操作簡單、經(jīng)濟的檢測MRSA新方法，對于控制感染和制定合理治療方案具有重大意義。
　　近紅外光譜分析技術(shù)是目前發(fā)展最快，最引人注目的一種分析技術(shù)。它以量子力學(xué)為基礎(chǔ)，反映有機化合物分子振動倍頻吸收和合頻吸收。因此可以通過分析近紅外光譜來獲得樣品中含氫基團(tuán)的特征信息。該技術(shù)分析樣品時具有快速、方便、準(zhǔn)確和成本較低，不破壞樣品，不消耗化學(xué)試劑，不污染環(huán)境等優(yōu)點，非常契合

3、我們所希望的耐藥菌檢測新方法的要求。光譜數(shù)據(jù)分析時會引入一些多元化學(xué)計量學(xué)算法用于數(shù)據(jù)處理和建模。
　　因此，本課題探索應(yīng)用近紅外光譜(NIRS)分析技術(shù)結(jié)合支持向量機(SVM)算法鑒別耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)和甲氧西林敏感金葡菌(MSSA)，以期建立一種新的檢測耐藥菌的新方法。
　　方法：
　　1.將標(biāo)準(zhǔn)株MRSA(ATCC43300)和MSSA(ATCC25923)活化、分離、純化，挑取單菌落接種于盛有

4、5ml LB肉湯的試管中，在恒溫振蕩箱中擴增18h，制備種子液。取200ul種子液加入盛有5ml LB肉湯試管中擴增，在0-24h內(nèi)，每隔兩小時記錄擴增菌液的光密度值。以時間為橫坐標(biāo)，光密度值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)菌生長曲線并確定對數(shù)生長期。
　　2.將對數(shù)生長期的菌液稀釋成不同濃度梯度，并測出其光密度值。將稀釋后的菌液10倍倍比稀釋7次，采用平板計數(shù)法計算出原有菌液濃度，建立實際濃度與光密度值之間關(guān)系曲線。
　　3.對研究對象進(jìn)

5、行科學(xué)分組，具體分為MRSA和MSSA兩大組，每組24個細(xì)菌樣本，共計48個。每個細(xì)菌樣本均擴增至對數(shù)期和配成濃度為1×109cfu/ml的標(biāo)準(zhǔn)菌液。
　　4.連接光源、近紅外光譜儀、光纖探頭和計算機，打開光譜采集軟件Spectrasuite，調(diào)試信號和設(shè)定參數(shù)，待光譜儀狀態(tài)穩(wěn)定后，采集菌液樣本光譜信號，每個菌液樣本按順時針方向采集20次，一共獲得960個光譜樣本。
　　5.將Spectrasuite軟件中光譜數(shù)據(jù)導(dǎo)出，以波

6、長為X軸，反射率為Y軸，分別制作MRSA和MSSA的原始光譜圖，使用鑒別指數(shù)D值定量描述光譜數(shù)據(jù)的重現(xiàn)性，并初步觀察分析MRSA和MSSA的差異。
　　6.對兩種細(xì)菌原始光譜曲線取平均值，并進(jìn)行平滑去噪、基線校正、一階求導(dǎo)和尋峰等預(yù)處理，力求使光譜間的差異變得更加顯著。對吸收峰進(jìn)行譜帶歸屬分析和相關(guān)系數(shù)分析，進(jìn)一步分析MRSA和MSSA的差異及其含義。
　　7.將原始光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，壓縮變量后進(jìn)行聚類分布投影，觀察分

7、類情況。再將壓縮后的主成分得分向量作為支持向量機輸入向量建立MRSA和MSSA的鑒別模型。以2/3樣本作為訓(xùn)練集，余下1/3樣本作為預(yù)測集，計算線性、多項式、徑向基三種核函數(shù)下模型分類和預(yù)測的正確率。建模前需確定徑向基核函數(shù)和多項式核函數(shù)的最佳核參數(shù)。
　　8.對臨床分離菌株使用紙片擴散法進(jìn)行耐藥性鑒定，并以鑒定結(jié)果作為參照。按前期探索構(gòu)建的MRSA和MSSA鑒別模型方法，使用近紅外光譜法檢測。
　　9.以紙片擴散法檢測結(jié)果

8、作為參照，對近紅外光譜檢測法準(zhǔn)確性進(jìn)行評價，同時參考文獻(xiàn)報道從分類準(zhǔn)確率、實驗耗時、操作步驟和價格等方面與其他主流檢測方法進(jìn)行比較。
　　結(jié)果：
　　1.通過分析MRSA和MSSA的生長曲線，我們認(rèn)為在8-14h，細(xì)菌光密度值增高較快，對應(yīng)細(xì)菌的對數(shù)生長期。兩種細(xì)菌的曲線變化趨勢相似，選擇對數(shù)期14h作為待測細(xì)菌擴增的時間。
　　2.根據(jù)對數(shù)期細(xì)菌光密度值和實際菌液濃度的關(guān)系，得到MSSA的濃度曲線公式為y=4.841

9、x-0.053R2=0.9931;MRSA的濃度曲線公式為y=5.466x-0.049R2=0.9924。（單位為109cfu/ml），并設(shè)定1×109cfu/ml為實驗菌株檢測濃度。
　　3.MRSA和MSSA組內(nèi)光譜曲線重現(xiàn)性考察，得到鑒別指數(shù)Dy1y2結(jié)果，MRSA的Dy1y2范圍為0-2，均值為0;MSSA的Dy1y2范圍為0-1，均值為0。實驗重現(xiàn)性好，儀器分析結(jié)果穩(wěn)定可靠。
　　4.光譜預(yù)處理后，發(fā)現(xiàn)在950.1

10、nm、1140.92nm、1330.63nm、1383.89nm、1494.81nm、1748.28nm、1857.1nm、1927.59nm、2021.16nm處有吸收峰，MRSA和MSSA的波峰位置、波形、峰值未見明顯差異。
　　5.對MRSA和MSSA近紅外全波段原始數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析后，發(fā)現(xiàn)前三主成分占有光譜總變異性百分比分別為81.482％、6.247％、3.077％，累計貢獻(xiàn)率超過90％。以這三個主成分PC1、PC2、

11、PC3作為聚類依據(jù)，繪制主成分聚類三維分布圖，可顯示較好區(qū)分效果。
　　6.在支持向量機建模前，使用訓(xùn)練集驗證最佳核參數(shù)，結(jié)果為多項式核參數(shù)為8，徑向基核參數(shù)為1.1。訓(xùn)練集分類正確率結(jié)果為，線性核函數(shù)：96.02％±0.50％;多項式核函數(shù)：98.73％±0.31％;徑向基核函數(shù)：99.72％±0.21％。測試集預(yù)測正確率結(jié)果為，線性核函數(shù)：95.69％±0.01％;多項式核函數(shù)：98.88％±0.00％;徑向基核函數(shù)：99.4

12、7％±0.00％，初步反映了近紅外光譜結(jié)合支持向量機算法所建立的MRSA標(biāo)準(zhǔn)株鑒別模型具有較高的分類準(zhǔn)確率。
　　7.近紅外光譜結(jié)合支持向量機算法建立的MRSA和MSSA鑒別模型檢測臨床分離金葡菌時，訓(xùn)練集樣本分類正確率為98.03％，測試集樣本分類正確率為98.5％，進(jìn)一步說明近紅外光譜分析技術(shù)在區(qū)分MRSA臨床株上具有較高的準(zhǔn)確率。
　　8.以紙片擴散法鑒定結(jié)果為參照，近紅外法檢測MRSA的一致百分率為98.5％，靈敏度

13、為97.00％，特異度為100.00％。使用Pearsonx2檢驗，列聯(lián)系數(shù)ψ=0.971，Kappa值0.970，說明近紅外光譜法與紙片擴散法具有強烈的正相關(guān)且結(jié)果有極強的一致性。
　　9.對MRSA的檢測方法的比較，在準(zhǔn)確性上，近紅外法98.5％，結(jié)果高于文獻(xiàn)中報道的MIC肉湯稀釋法(91％)、耐藥蛋白檢測法(97.6％);在檢測耗時上，近紅外法耗時14h，低于紙片擴散法(24-48h)、MIC肉湯稀釋法(24-36h)、瓊脂

14、稀釋法(24h);在操作步驟上，近紅外法簡單，技術(shù)人員只需簡單培訓(xùn)便可獨自完成;在價格上，近紅外法每次只需耗費10-20元耗材，低于紙片擴散法（80元/次）和肉湯稀釋法（250元/次），更遠(yuǎn)低于PCR法和PBP2a法。
　　結(jié)論：
　　利用近紅外光譜結(jié)合支持向量機算法構(gòu)建MRSA和MSSA鑒別模型是具有高度的準(zhǔn)確性和可行性。在檢測準(zhǔn)確性、檢測耗時、操作步驟、耗材價格等方面與紙片擴散法、最小抑菌濃度法、PCR法、耐藥蛋白檢測法