同種異體組織工程化軟骨局部免疫豁免誘導的實驗研究.pdf

1、為了構建局部免疫耐受的同種異體組織工程化軟骨，延長其在體內存活時間．我們首先應用RT-PCR和TA克隆技術從激活的小鼠脾臟淋巴細胞總RNA中擴增mFasL cDNA并克隆到T載體，并經(jīng)測序確證。為了探討逆轉錄病毒載體系統(tǒng)轉染同種異體軟骨細胞的最佳條件，本研究利用增強型綠色熒光蛋白EGFP）具有表達熒光特異性高、易于檢測等獨特的優(yōu)勢，構建能穩(wěn)定表達EGFP的重組逆轉錄病毒載體EGFP－PLNCX2，轉染同種異體軟骨細胞，熒光顯微鏡觀察轉染

2、的效果，流式細胞儀測定轉染的效率。為了觀察逆轉錄病毒載體系統(tǒng)介導體軟骨細胞后是否影響軟骨的構建，利用以上EGFP重組逆轉錄病毒載體轉染的的軟骨細胞和組織工程材料 pluronic-27復合物構建兔同種異體組織工程軟骨 ，熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡觀察其構建過程和逆轉錄病毒載體系統(tǒng)介導基因的體內表達格局；在掌握逆轉錄病毒載體系統(tǒng)介導基因的體外和體內規(guī)律后，構建目的基因FasL（CD178）的逆轉錄病毒載體系統(tǒng)，RT-PCR、免疫印跡、免

3、疫組織化學、流式細胞儀和生物學活性等多種水平證實mFasL（CD178）蛋白在該系統(tǒng)的表達，最后利用FasL（CD178）重組逆轉錄病毒載體轉染的軟骨細胞和組織工程材料 pluronic F-127復合物構建兔同種異體組織工程軟骨，與未轉染者比較其在體內的轉歸。結果顯示：重組逆轉錄病毒載體EGFP-PLNCX2能有效地轉染軟骨細胞。重組逆轉錄病毒載體轉染的軟骨細胞能形成組織工程軟骨，增強型綠色熒光蛋白（EGFP）是組織工程化軟骨形成過程