壬基酚（4-Nonylphenol）和雙酚A（Bisphenol A）對(duì)鯽（Carassius auratus）原代培養(yǎng)肝細(xì)胞的毒性及雌激素效應(yīng).pdf

1、目前，環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(endocrine disrupting chemicals，EDCs)對(duì)人類(lèi)和野生生物的有害影響引起了許多國(guó)際組織和世界各國(guó)政府的關(guān)注，成為本世紀(jì)生命科學(xué)和環(huán)境科學(xué)的重大議題之一。對(duì)EDCs內(nèi)分泌擾亂研究，在陸生動(dòng)物方面主要集中在雄性或雌性動(dòng)物生殖功能的影響、癌癥細(xì)胞的增殖效應(yīng)等方面；在水生動(dòng)物研究方面，主要集中在對(duì)魚(yú)類(lèi)的氧化毒性和雌激素效應(yīng)以及蛋白生物標(biāo)志物上。對(duì)壬基酚(4-Nonylphenol，NP)和雙

2、酚A(Bisphenol A，BPA)的生物毒性評(píng)價(jià)迫切需要能夠反映NP和BPA在環(huán)境中的實(shí)際毒性效應(yīng)的方法，但是NP和BPA的化學(xué)分析方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力、費(fèi)用昂貴。因此，研究NP和BPA的生物分析方法成為了生態(tài)毒理學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)，本文研究了NP和BPA對(duì)鯽原代培養(yǎng)肝細(xì)胞的毒性作用和雌激素效應(yīng)。 一、 采用Percoll法建立鯽肝細(xì)胞原代培養(yǎng)模型 建立從非實(shí)質(zhì)細(xì)胞和血細(xì)胞中分離得到高純度和活力肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的方法是對(duì)硬骨魚(yú)類(lèi)肝

3、細(xì)胞研究的前題條件。本實(shí)驗(yàn)用percoll液密度梯度離心的方法分離得到了高純度和活力的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞。以Ⅳ型膠原酶消化法分離鯽肝細(xì)胞，然后將其分成2組，1組不再經(jīng)過(guò)進(jìn)一步處理(即對(duì)照組)；另1組再用Percoll液密度梯度離心純化肝細(xì)胞(即實(shí)驗(yàn)組)，然后將兩組細(xì)胞接種于DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)10d。在倒置顯微鏡下觀察兩組肝細(xì)胞的形態(tài)并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線；采用臺(tái)盼藍(lán)染色法比較兩組肝細(xì)胞的存活率；通過(guò)H.E染色法在光鏡下檢測(cè)肝細(xì)胞的純度；采

4、用MTT比色法測(cè)定兩組肝細(xì)胞的增殖率；收集肝細(xì)胞培養(yǎng)上清液檢測(cè)白蛋白、尿素以及乳酸脫氫酶的水平以檢測(cè)兩組肝細(xì)胞功能。結(jié)果表明，對(duì)照組鯽肝細(xì)胞存活率為80.6％，純度為83.2％；實(shí)驗(yàn)組肝細(xì)胞存活率和純度明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，分別為94.2％和95.1％。從開(kāi)始接種到大部分肝細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組肝細(xì)胞的增殖明顯加快(P<0.05)。白蛋白分泌功能、尿素合成能力及乳酸脫氫酶檢測(cè)結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)上清液中白蛋白分泌量、尿素

5、合成能力明顯高于對(duì)照組(P<0.05)；而乳酸脫氫酶含量明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。 二、 壬基酚和雙酚A對(duì)鯽原代培養(yǎng)肝細(xì)胞毒性作用 用10<'-4>mol/L、10<'-5>mol/L、10<'-6>mol/L、10<'-7>mol/L、10<'-8>mol/L NP和BPA分別暴露鯽原代培養(yǎng)肝細(xì)胞48h，用MTT法測(cè)定NP和BPA對(duì)肝細(xì)胞生長(zhǎng)抑制影響；測(cè)定培養(yǎng)基中乳酸脫氫酶(LDH)含量，分析NP和BPA對(duì)肝細(xì)

6、胞膜損傷的影響；測(cè)定肝細(xì)胞丙二醛(MDA)和谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶(GST)的含量，分析NP和BPA對(duì)肝細(xì)胞氧化損傷作用；用熒光分光光度計(jì)測(cè)定肝細(xì)胞EROD的含量，建立NP和BPA對(duì)肝細(xì)胞EROD誘導(dǎo)的劑量效應(yīng)關(guān)系。結(jié)果表明當(dāng)NP濃度≥10<'-7>mol/L或BPA濃度≥10<'-5>mol/L時(shí)肝細(xì)胞活力明顯降低(P<0.05)。當(dāng)NP濃度≥10<'-7>mol/L或BPA濃度≥10<'-6>mol/L時(shí)肝細(xì)胞LDH漏出量明顯增加(P<

7、0.05)。當(dāng)NP濃度≥10<'-7>mol/L或BPA濃度≥10<'-6>mol/L時(shí)肝細(xì)胞MDA含量明顯增加(P<0.05)。當(dāng)濃度≥10<'-7>mol/L時(shí)，NP和BPA均能引起肝細(xì)胞氧化損傷使GST酶含量增加(P<0.05)。當(dāng)NP濃度≥10<'-8>mol/L或BPA濃度≥10<'-7>mol/L時(shí)與對(duì)照組相比肝細(xì)胞EROD含量明顯增加。NP和BPA對(duì)EROD誘導(dǎo)的EC<,50>分別是277nmol/L，1261nmol/L

8、；劑量效益曲線方程為分別為：NP：Y=3.86781n(X)+15.523；R<'2>=0.9721BPA：Y=4.51021n(X)+3.5501；R<'2>=0.9642 由以上結(jié)果可知NP對(duì)肝細(xì)胞的毒性作用強(qiáng)于BPA,對(duì)EDCs的檢測(cè)靈敏度強(qiáng)弱依次為：EROD>GST>MDA，LDH。 三、 壬基酚和雙酚A對(duì)鯽原代培養(yǎng)肝細(xì)胞卵黃蛋白原的誘導(dǎo) 卵黃蛋白原(VTG)作為檢測(cè)環(huán)境雌激素生物標(biāo)志物的研究已成為生態(tài)毒理學(xué)

9、研究的熱點(diǎn)。在雌激素誘導(dǎo)下，魚(yú)類(lèi)肝臟VTG mRNA表達(dá)敏感性高、受外界干擾小，因此，魚(yú)肝臟VTG mRNA可以作為一種新的標(biāo)志物而應(yīng)用到環(huán)境雌激素的檢測(cè)中去。 本實(shí)驗(yàn)用10<'-7>mol/L、10<'-5>mol/L NP和10<'-6>mol/L、10<'-4>mol/L BPA分別暴露作用鯽原代培養(yǎng)肝細(xì)胞48h，用Trizol法提取肝細(xì)胞總RNA，用自己設(shè)計(jì)的引物，通過(guò)RT-PCR.的方法檢測(cè)肝細(xì)胞VTG mRNA表