A型肉毒毒素治療大鼠三叉神經(jīng)痛的中樞作用機(jī)制研究.pdf

1、三叉神經(jīng)痛是臨床上最為痛苦和常見(jiàn)的神經(jīng)病理性疼痛之一。臨床表現(xiàn)為局限于三叉神經(jīng)分布區(qū)域的單側(cè)短暫性電擊樣或刀割樣劇痛。它的首選治療為口服藥物治療，在口服藥物治療無(wú)效的情況下可以考慮手術(shù)治療，然而有不少患者經(jīng)過(guò)多種治療后效果仍不理想。A型肉毒毒素是革蘭氏陽(yáng)性厭氧芽孢肉毒桿菌釋放的一種外毒素，廣泛應(yīng)用于肌張力障礙治療和美容領(lǐng)域。近年來(lái)，它在疼痛治療方面的研究越來(lái)越多，2012年我們改進(jìn)了A型肉毒毒素治療三叉神經(jīng)痛的技術(shù)路線，在國(guó)際上首次用隨

2、機(jī)、雙盲、安慰劑對(duì)照的試驗(yàn)方法證實(shí)了 A型肉毒毒素能夠長(zhǎng)期有效的緩解三叉神經(jīng)痛的疼痛且不良反應(yīng)輕微。隨后的多項(xiàng)臨床研究也得出了相似的結(jié)論。但是 A型肉毒毒素治療三叉神經(jīng)痛的機(jī)制仍不清楚。為此，我們建立大鼠眶下神經(jīng)慢性縮窄環(huán)術(shù)三叉神經(jīng)痛模型，探討 A型肉毒毒素對(duì)三叉神經(jīng)痛的治療作用、作用部位和作用機(jī)制。為 A型肉毒毒素治療三叉神經(jīng)痛和其他疼痛性疾病提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。
　　第一部分大鼠眶下神經(jīng)慢性縮窄環(huán)術(shù)建立三叉神經(jīng)痛模型的行為學(xué)和組

3、織學(xué)研究
　　目的：
　　建立大鼠眶下神經(jīng)慢性縮窄環(huán)術(shù)三叉神經(jīng)痛模型，模擬經(jīng)典三叉神經(jīng)痛，觀察術(shù)后大鼠的疼痛行為學(xué)和眶下神經(jīng)組織學(xué)改變。
　　方法：
　　實(shí)驗(yàn)組大鼠經(jīng)口建立眶下神經(jīng)慢性縮窄環(huán)術(shù)三叉神經(jīng)痛模型，對(duì)照組只暴露眶下神經(jīng)而不結(jié)扎。用Von Frey filaments對(duì)兩組術(shù)前和術(shù)后每2天大鼠的疼痛學(xué)行為進(jìn)行評(píng)價(jià)；采用HE染色和MBP免疫組織化學(xué)染色對(duì)術(shù)前和術(shù)后14天眶下神經(jīng)組織學(xué)改變進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　

4、　結(jié)果：
　　實(shí)驗(yàn)組術(shù)后第4天出現(xiàn)一明顯的不應(yīng)期，同側(cè)面部疼痛閾值顯著上升，第6天疼痛閾值達(dá)到高峰，為24.6±8.6g，與術(shù)前相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。隨后疼痛閾值急劇下降，在術(shù)后第14天達(dá)到5.5±2.3g（P＜0.05），這一趨勢(shì)至少持續(xù)至術(shù)后34天。
　　對(duì)照組術(shù)前和術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)疼痛閾值相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。
　　實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組術(shù)前疼痛閾值分別為13.5±3.6g和12.6±5.5g，兩者相

5、比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。兩組間疼痛閾值在術(shù)后第10天分別為5.5±3.2g和13.6±4.8g，組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），這一差異至少持續(xù)至術(shù)后第34天。
　　HE染色和MBP免疫組織化學(xué)染色表明實(shí)驗(yàn)組術(shù)后第14天眶下神經(jīng)存在明顯的脫髓鞘改變，而對(duì)照組與術(shù)前相比無(wú)顯著變化。
　　結(jié)論：
　　大鼠眶下神經(jīng)慢性縮窄環(huán)術(shù)三叉神經(jīng)痛模型符合經(jīng)典三叉神經(jīng)痛的臨床特點(diǎn)和組織學(xué)改變。該模型簡(jiǎn)單易行，我們可以利用該

6、模型探討三叉神經(jīng)痛的發(fā)病機(jī)制，研究新的治療方法。
　　第二部分 A型肉毒毒素對(duì)大鼠三叉神經(jīng)痛模型的抗傷害感受作用研究
　　目的：
　　用A型肉毒毒素對(duì)三叉神經(jīng)痛模型進(jìn)行干預(yù)，觀察大鼠疼痛行為學(xué)的改變。
　　方法：
　　大鼠眶下神經(jīng)慢性縮窄環(huán)術(shù)建立三叉神經(jīng)痛模型術(shù)后第14天，實(shí)驗(yàn)組在手術(shù)同側(cè)面部須墊部皮下注射A型肉毒毒素（3U/Kg和10U/Kg），對(duì)照組在同樣部位注射等量的生理鹽水。用Von Frey fi

7、laments對(duì)各組術(shù)前和術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)的疼痛學(xué)行為進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　結(jié)果：
　　A型肉毒毒素治療后第4天（術(shù)后第18天），3U組和10U組痛覺(jué)閾值均顯著升高，與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），這一差異至少持續(xù)至治療后20天（術(shù)后34天）。10U組同一時(shí)間點(diǎn)疼痛閾值高于3U組，但兩組間痛覺(jué)閾值對(duì)比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　A型肉毒毒素須墊部皮下注射可以顯著升高大鼠三叉神經(jīng)痛模型的疼痛閾

8、值，提高其抗傷害感受能力。
　　第三部分 A型肉毒毒素治療大鼠三叉神經(jīng)痛的作用部位研究目的
　　在前兩部分研究的基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)A型肉毒毒素的特異性標(biāo)記物cSNAP-25的檢測(cè)，研究A型肉毒毒素治療三叉神經(jīng)痛的作用部位，探討軸突運(yùn)輸在A型肉毒毒素治療三叉神經(jīng)痛中的作用。
　　方法：
　　大鼠眶下神經(jīng)慢性縮窄環(huán)術(shù)后13.5天，實(shí)驗(yàn)組在三叉神經(jīng)節(jié)內(nèi)注射軸突運(yùn)輸抑制劑秋水仙堿，對(duì)照組注射等量生理鹽水。術(shù)后14天在手術(shù)同側(cè)

9、面部須墊部皮下注射A型肉毒毒素（10U/Kg）或生理鹽水溶液。觀察不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠對(duì)疼痛刺激的變化，探討軸突運(yùn)輸在A型肉毒毒素治療三叉神經(jīng)痛中的作用。
　　用Western blot和免疫熒光對(duì)A型肉毒毒素的特異性標(biāo)志物cSNAP-25進(jìn)行檢測(cè)，觀察A型肉毒毒素在三叉神經(jīng)痛模型大鼠的作用部位。
　　結(jié)果：
　　實(shí)驗(yàn)組用秋水仙堿阻斷軸突運(yùn)輸降低了 A型肉毒毒素的抗傷害感受作用，A型肉毒毒素治療后第4天實(shí)驗(yàn)組疼痛閾值顯著

10、低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），這一差異持續(xù)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。
　　A型肉毒毒素治療后7天，通過(guò)western-blot和免疫熒光檢測(cè)到大鼠三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)亞核cSNAP-25水平明顯增高。三叉神經(jīng)節(jié)注射秋水仙堿阻斷軸突運(yùn)輸后，可以阻斷其增高。Western blot表明三叉神經(jīng)節(jié)注射秋水仙堿阻斷軸突運(yùn)輸后三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)亞核cSNAP-25較對(duì)照組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論：

11、　　秋水仙堿阻斷軸突運(yùn)輸后使 A型肉毒毒素的抗傷害感受作用顯著減弱。A型肉毒毒素通過(guò)軸突運(yùn)輸至三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)亞核發(fā)揮作用。
　　第四部分 TRPs在A型肉毒毒素治療大鼠三叉神經(jīng)痛中的作用機(jī)制研究
　　目的：
　　探討痛覺(jué)相關(guān)TRPs（TRPA1、TRPV1、TRPV2及TRPM8）在A型肉毒毒素對(duì)大鼠三叉神經(jīng)痛模型發(fā)揮抗傷害感受作用的機(jī)制。
　　方法：
　　TRPA1、TRPV1、TRPV2和TRPM8

12、是TRPs家族中可能與疼痛相關(guān)的離子通道，為了進(jìn)一步明確 A型肉毒毒素對(duì)三叉神經(jīng)痛抗傷害感受的機(jī)制，采用Western blot對(duì)三叉神經(jīng)痛模型三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)亞核不同時(shí)間點(diǎn)的TRPA1、TRPV1、TRPV2和TRPM8蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，觀察這些蛋白在三叉神經(jīng)痛模型中的動(dòng)態(tài)變化。同時(shí)用Western blot檢測(cè)A型肉毒毒素同側(cè)面部須墊部皮下注射（3U/Kg和10U/Kg）對(duì)三叉神經(jīng)痛模型三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)亞核中TRPA1、TRPV

13、1、TRPV2和TRPM8蛋白表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：
　　Western blot表明三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)亞核中TRPA1和TRPV1的表達(dá)水平在眶下神經(jīng)慢性縮窄環(huán)術(shù)后第14天明顯增高（P＜0.05），在術(shù)后第28天仍顯著增高（P＜0.05）。TRPV2在術(shù)后第7天表達(dá)明顯增高（P＜0.05），術(shù)后第28天仍然持續(xù)增高（P＜0.05）。TRPM8在術(shù)后第7天開始增高，在術(shù)后第14天達(dá)到高峰，術(shù)后第28天與對(duì)照組相比仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)

14、差異（P＜0.05）。
　　A型肉毒毒素治療后第14天，Western blot表明大鼠三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)亞核中TRPA1和TRPV1的表達(dá)較對(duì)照組顯著降低（P＜0.05），A型肉毒毒素降低TRPA1和TRPV1的表達(dá)有劑量依賴的效果，10U組的TRPA1和TRPV1的表達(dá)與3U相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。A型肉毒毒素（10U/Kg）治療后第14天顯著降低了TRPV2的表達(dá)（P＜0.05），3U組TRPV2的表達(dá)水平與對(duì)照組