中間球海膽與光棘球海膽的雜交及分子遺傳學研究.pdf

1、本文以中間球海膽(Strongylocentrotus intermedius)、光棘球海膽(s.nudus)及其雜交的F<,1>代為材料，通過分子標記、構建遺傳連鎖圖譜及基因表達差異等分子遺傳學技術對兩種海膽雜交產生的包括雜交優(yōu)勢在內的遺傳變異進行了相關的研究，為海膽雜交育種提供了遺傳學依據。 主要內容包括： 1雜交海膽的分子鑒定及生物學性狀特征。 1．1從24對SSR引物中篩選出一對，能對父母本和雜交種的基因

2、組DNA進行有效擴增，并且擴增條帶清晰穩(wěn)定。利用雜交海膽中同時擁有父母本的互補帶型，對雜交海膽進行了分子鑒定。 1.2雜交海膽的外部形態(tài)特征介于雙親之間，正反交的F．代殼色、棘色等形態(tài)特征接近，都有兩種表型(一種殼為紫褐色，棘發(fā)白、尖部略紫；另一種殼和棘均為紫色)，并且兩種表型所占比例不同，殼徑在lcm左右時正交F<,1>代(中間球海膽♂×光棘球海膽♂)中為74.O％和26.0％，反交F．代(光棘球海膽♀×中間球海膽♂)中各占6

3、8.1％和31.9％；殼徑3cm左右時正交F<,1>代為77.2％和22.8％，反交F<,1>代各占70.5％和29.5[％]。交F,,1>代的生殖腺重、殼徑、體重等平均值都比母本具有不同程度的優(yōu)勢，有的時間達到顯著水平。有近10％的雜種生殖腺顏色不如母本鮮艷。 2雜交海膽(中間球海膽♀×光棘球海膽♂)群體多樣性的AFLP分析及AFLP標記與數量性狀的相關性分析。 2．1對光棘球海膽(NU)、中間球海膽(IN)及其雜交的

4、F<,1>代(中間球海膽♀×光棘球海膽♂)(HYb，HYc兩種表型)3個群體進行了AFLP分析，并根據遺傳距離進行了個體聚類分析。結果表明：3個群體的多態(tài)位點比例分別是：81.99％，80.51％和95.95％。香農多樣性指數分別為：0.2331±0.1273，0.2005±0.1385和0.2625±0.1067。遺傳相似度分別為：O.6876±0.0523，0.6501±0.0548和0．6552±0.0553。分子方差分析(AMO

5、VA)分析結果表明，變異來源有25.39[％]來自群體間，有74.6l％來自群體內。盡管雜交海膽在表型上可以明顯分成兩種類型，但是通過AFLP統(tǒng)計的遺傳距離進行的個體聚類卻聚在一起，不能分成兩個群體。 2.2對雜交海膽的生殖腺、殼徑、體重、棘長等數量性狀與AFLP標汜進行的相關性分析結果表明：在4對引物產生的標記中，18個標記與生殖腺重量相關顯著，3個相關極顯著，最高貢獻率為17.16％；21個標記與殼徑相關顯著，5個相關極顯著

6、，最高貢獻率達到19.82％；17個標記與體重相關顯著，6個相關極顯著，最高貢獻率達到18.31％；9個標記與棘長相關顯著。其中有多個標記與同一性狀相關，標記中的多數也同時與幾個性狀相關。 3初步構建了光棘球海膽與中間球海膽的遺傳連鎖圖譜。利用42對引物組合及1對單對雜交的父母本個體和F．代的60個個體通過“雙假測交”策略，構建了光棘球海膽(♀)和中間球海膽(♂)的遺傳連鎖圖譜。光棘球海膽包括24個連鎖群，194個AFLP標記，

7、標記間平均間隔17.1cM，覆蓋基因組總長度2988．3cM；中間球海膽包括23個連鎖群，199個AFLP標記，平均問隔15.4cM，總長度2614．8cM。 4光棘球海膽的主要卵黃蛋白MYP(major yolk protein)cDNA全序列的克隆和分析及MYP基因在中間球海膽和雜交F1，代(中間球海膽♀×光棘球海膽♂)生殖腺不同發(fā)育時期的轉錄表達差異。 4．1光棘球海膽的MYP cDNA全長4047 bp，編碼13

8、49個氨基酸。序列比對結果表明，MYP的3個區(qū)域(133—474；490—658；941一1089)表現(xiàn)出與脊椎動物鐵傳遞蛋白的保守結構域同源。MYP中的半胱氨酸在20個位置與鐵傳遞蛋白相一致。說明MYP是鐵輸送蛋白，這與其它動物的卵黃蛋白是不同的。同時通過MYP cDNA序列分析了8種海膽的進化關系，光棘球海膽與紅海膽的遺傳距離最近，為0.069±0.01，與同科的馬糞海膽、紫球海膽、中間球海膽的遺傳距離分別是0.095±0.012、

9、0.098±0.011和0.10l±0.012。與白棘三列海膽、擬球海膽及綠海膽的遺傳距離分別為0.216±0.017、0.218±0.018和0.535±0.028。 4．2 Real time RT—F'CR結果表明：MYP基因在海膽雌雄個體生殖腺中轉錄水平上的表達差異不明顯。MYP基因在中間球海膽生殖腺發(fā)育的4個時期的表達呈快速的下降趨勢，而在雜交海膽呈緩慢下降的趨勢。在生殖腺的4個發(fā)育期中，中間球海膽的雌雄個體的MYP基